葡萄類病毒基因多樣性分析及其侵染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、類病毒是是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物。葡萄是我國一種重要的經(jīng)濟作物，2006年我國葡萄產(chǎn)量和栽培面積分居世界第4位和第5位.現(xiàn)已經(jīng)證明它可以被5種類病毒侵染：啤酒花矮化類病毒(Hop stunt viroid，簡稱HSVd)，澳大利亞葡萄類病毒(Australian grapevine viroid，簡稱AGVd)，柑橘裂皮類病毒(Citrus exocortis viroid，簡稱CEVd)，葡萄黃痘類病毒-1(Grapevineyel

2、low speckle viroid-1，簡稱GYSVd-1)和葡萄黃痘類病毒-2(Grapevineyellow-speckle viroid-2，簡稱GYSVd-2)。其中澳大利亞葡萄類病毒(AGVd)是由多種類病毒通過廣泛重組產(chǎn)生的一個重組體，是研究類病毒進(jìn)化、重組的典型材料，但在葡萄上的致病性尚未明確。目前世界上只有澳大利亞，突尼斯及中國報道過此類病毒。GYSVd-2能單獨引起葡萄黃痘病，導(dǎo)致葡萄的品質(zhì)和產(chǎn)量下降，由于其低侵染性

3、，關(guān)于GYSVd-2的報道較少，目前世界上只有澳大利亞和中國兩個國家報道過。因此，對它們的研究對于今后指導(dǎo)類病毒的基礎(chǔ)性研究工作，以及生產(chǎn)實踐等具有重要意義。 本文旨在通過分子生物學(xué)方法，從葡萄上鑒定并分離AGVd、GYSVd-2，克隆、測序后利用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比較，分析其種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性，為研究類病毒的起源、進(jìn)化、重組及致病機制打下基礎(chǔ)，同時為研究類病毒的傳播流行規(guī)律和防治提供理論依據(jù)。 本文對采自北京、沈陽、

4、新疆和福建等省市的的89個葡萄樣品中的AGVd及GYSVd-2的帶毒情況進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：(1)在北京樣品(品種為井川、早玉)及新疆樣品(品種為無核白)中檢測到AGVd；(2)在北京樣品(品種為黑奧林、早玉)及新疆樣品(品種為無核白)中檢測到GYSVd-2。其余樣品中未檢測到這兩種類病毒。設(shè)計AGVd，GYSVd-2的特異引物，對檢測陽性的葡萄樣品的RNA進(jìn)行克隆、測序和序列分析。結(jié)果表明，(1)AGVd、GYSVd-2序列變異較小，

5、每一個品種的類病毒分離物都表現(xiàn)出準(zhǔn)種特性。(2)相對于國外的分離物，中國地區(qū)的分離物呈現(xiàn)出其獨特的堿基變化，這些變化多分布于保守區(qū)之外的致病區(qū)(P)和可變區(qū)(V)；進(jìn)化距離和二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，這些變異的序列堿基在不同程度上影響了其二級結(jié)構(gòu)，這是否與類病毒的致病性有關(guān)有待進(jìn)一步的研究。(3)對GenBank中已報道的GYSVd序列及本文獲得的GYSVd-2序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)一種新的類病毒(暫命名為CGVd)，CGVd序列與GYSVd-

6、1、GYSVd-2同源性均小于90％，根據(jù)CGVd的分子特征及國際病毒分類委員會分類基準(zhǔn)，我們將其作為一個新種歸入蘋果繡果類病毒屬，并建議命名為葡萄黃痘類病毒-3(Grapevineyellow speckle viroid-3，簡稱GYSVd-3)。 本研究獲得并登錄了123條AGVd、37條GYSVd-2的全序列，極大的豐富了GenBank中葡萄類病毒的序列信息量。 此外，通過分子生物學(xué)方法，本研究還成功構(gòu)建了AGV