C4植物PEPCase單克隆抗體的制備與ELISA檢測方法的建立.pdf

1、光合作用是作物生物產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)。C4植物比C3植物具有更高的光能利用效率，主要是因為C4植物葉片中有Kranz結(jié)構(gòu)和具有獨特的CO2固定途徑。PEPCase是C4途徑的首要關(guān)鍵酶，因此，人們希望通過轉(zhuǎn)基因手段將C4植物的PEPC基因?qū)胨?，將這一優(yōu)勢特征引入C3作物，從而提高光合效率及產(chǎn)量潛力。目前，外源基因轉(zhuǎn)入受體物種后，對目標(biāo)基因的檢測方法主要有三種:(1)生物測試法;(2)DNA檢測;(3)蛋白的免疫檢測。而免疫檢測比其他方法

2、具有快速、便捷、靈敏、準(zhǔn)確、廉價等優(yōu)點。為了在蛋白表達(dá)水平上快速檢測轉(zhuǎn)基因作物，加快C4轉(zhuǎn)基因的高光效作物育種進(jìn)程，本試驗制備了PEPCase的單克隆抗體，并建立了雙夾心ELISA檢測方法。
　　 用PEPCase作為抗原免疫BALB/c小鼠，利用其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，經(jīng)間接ELISA篩選，采用有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆后，得到3株分泌抗PEPCase單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3C11、1B9和4E5，并制備腹

3、水型單抗，采用辛酸-硫酸銨法純化單抗。用PEPCase作為抗原免疫新西蘭大白兔，取血清，采用硫酸銨多步沉淀法純化兔源多抗。經(jīng)過亞型鑒定，3C11和1B9為IgG1型，4E5為IgG2a型。經(jīng)測定，3C11和4E5腹水型單抗的效價均為1∶128000，1B9腹水型單抗的效價為1∶4000，兔源多抗的效價為1∶32000。3C11、1B9和4E5三種腹水型單抗中蛋白濃度分別為6.78mg/mL、6.97mg/mL、5.81mg/mL，多抗的

4、蛋白濃度為21.48mg/mL。進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western-blot檢測，單抗的特異性好。競爭結(jié)合法測定單抗親和常數(shù)，4E5約為2.21×10-8M，說明單抗與PEPCase的親和性較好。
　　 利用4E5雜交瘤細(xì)胞株的小鼠腹水單抗和兔源多抗，建立了檢測PEPCase的多抗-待檢樣品-單抗的雙夾心ELISA方法。經(jīng)測定，多抗的最佳工作濃度為6.71μg/mL，單抗的最佳工作濃度為7.26μg/mL，檢測靈敏度為5μ