重金屬鋅離子單克隆抗體的制備及阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、重金屬鋅（Zn）是動(dòng)物體內(nèi)不可或缺的元素，因此各類(lèi)動(dòng)物性食品中都含有鋅。鋅是人體含量最多的微量元素，其含量高達(dá)3g之多，主要以鋅離子的形式參與體內(nèi)的代謝，參與人體內(nèi)200多種酶的合成與活化，是機(jī)體新陳代謝中必不可少的物質(zhì)。鋅離子通過(guò)參與體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成來(lái)促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞的分裂、生長(zhǎng)和再生，從而影響兒童和青少年的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　人體缺鋅時(shí)會(huì)引起一系列的生理現(xiàn)象紊亂，包括組織器官的生理功能異常。如生長(zhǎng)發(fā)育不良、食欲不振、智力發(fā)育差等，同時(shí)

2、味覺(jué)和視覺(jué)也會(huì)受影響。
　　鋅與其它元素在人體內(nèi)的比例與人的健康關(guān)系很大。當(dāng)鋅銅比值過(guò)大時(shí)易發(fā)生高血壓、冠心病。鋅鉬比值過(guò)大則預(yù)示著癌癥晚期。
　　人體攝入鋅的量過(guò)多時(shí)，會(huì)造成人體鋅中毒，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉，損害肝、腎、血管和心臟功能，甚至造成死亡。因此研發(fā)一種快速、高效的方法去檢測(cè)食品和環(huán)境中重金屬鋅離子的含量來(lái)保證食品安全顯得尤為重要。
　　本文主要采用分子偶聯(lián)技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、免疫酶技術(shù)，建立重金屬鋅離子的一種新的

3、免疫檢測(cè)方法。
　　通過(guò)采用異硫氰酯法用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）將 Zn2+和 BSA偶聯(lián)形成完全抗原 Zn2+-ITCBE-BSA。同理，使用相同的方法螯合 Zn2+和 OVA形成包被原Zn2+-ITCBE-OVA。通過(guò)核酸蛋白分析儀、SDS-PAGE電泳、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和免疫小鼠后多抗血清的ELISA鑒定：免疫原與包被原的蛋白濃度分別為8.48 mg/mL和9.23 mg/mL；Zn2+含量分別為

4、101.1μg/mL和90.09μg/mL；間接ELISA效價(jià)達(dá)到1:1.28×104，阻斷ELISA檢測(cè)Zn2+-EDTA的半數(shù)抑制濃度（IC50）為26.85 ng/mL，與EDTA及其它金屬離子螯合物無(wú)交叉反應(yīng)。
　　采用背部多點(diǎn)注射免疫法將Zn2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠5只，5次免疫后，用間接ELISA方法和阻斷ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)篩選出備用融合小鼠。通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)，間接ELISA方法和阻斷ELISA

5、方法篩選出2B3D8、2A11E1和4B6C4共3株敏感特異的雜交瘤細(xì)胞株，用體內(nèi)誘生腹水法制備Zn2+-EDTA mAb，間接ELISA檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)分別為1:2.56×103、1:1.28×103、1:2.56×103，腹水效價(jià)分別為1:2.26×105、1:1.18×104、1:1.18×105，同種型分別為IgG1/κ、IgG1/κ、IgG1/λ，其中特異性最好的2B3D8株，其IC50為26.85μg/L，與其它金屬離

6、子螯合物無(wú)交叉反應(yīng)。本試驗(yàn)制備的Zn2+-EDTA pAb和Zn2+-EDTA mAb均可用于Zn2+污染的免疫學(xué)檢測(cè)，其中Zn2+-EDTA mAb效果更好。
　　應(yīng)用Zn2+-EDTA mAb研制出Zn2+污染快速檢測(cè)試劑盒（Zn2+-Kit），用阻斷ELISA測(cè)其靈敏度，添加回收試驗(yàn)測(cè)其準(zhǔn)確度，批內(nèi)批間試驗(yàn)測(cè)其精確度，交叉反應(yīng)試驗(yàn)測(cè)其特異性。試劑盒靈敏度為7.46 ng/mL，添加回收試驗(yàn)和批內(nèi)批間試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于15％