胭脂紅單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、胭脂紅(Ponceau4R，P4R)又稱麗春紅4R，酸性紅18，是目前我國使用最廣泛、用量最大的一種單偶氮類人工合成色素，由于其成本低廉、色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、配色方便，在我國食品生產(chǎn)加工等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。然而，后來的一些研究表明胭脂紅具有潛在的毒性。自2008年起，歐洲、北美等多個(gè)國家已陸續(xù)禁止在食品中添加胭脂紅，我國雖然也對(duì)其使用范圍和使用限量都有嚴(yán)格的規(guī)定，但仍然存在嚴(yán)重的濫用現(xiàn)象。
　　一些食品加工者利用胭脂紅的特性超量或

2、超范圍的添加到包括飲料、零食、海鮮、肉制品等食品當(dāng)中，對(duì)我們的食品安全構(gòu)成威脅，胭脂紅殘留的現(xiàn)有檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的儀器分析法，如色譜法、質(zhì)譜法、光譜法及電化學(xué)分析法等，常用的主要是高效液相色譜法。然而，儀器分析法不僅需要貴重的儀器及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，其較為繁瑣的樣品處理過程還需要相關(guān)技術(shù)人員進(jìn)行操作，這些不方便因素使得以上檢測(cè)方法并不適用于現(xiàn)場(chǎng)高通量的樣品檢測(cè)。因此，設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單、有效、快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法十分必要，免疫分析法由于基于抗原抗體

3、的特異性結(jié)合而具有高度的選擇性和靈敏度，其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、高效且便于攜帶，適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的快速篩選，目前僅見到針對(duì)胭脂紅的多克隆抗體，這大大降低了免疫分析方法的特異性，其效果較單克隆抗體差的很多。
　　本實(shí)驗(yàn)采用鹵代羧酸法與戊二醛法分別合成了胭脂紅及其衍生物的免疫原和檢測(cè)原，經(jīng)過透析、鑒定后對(duì)比得到穩(wěn)定、效價(jià)高、免疫效果良好的免疫原和準(zhǔn)確、間隔臂干擾低的檢測(cè)原。用合成的免疫原分批對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，通過細(xì)胞融合技術(shù)、EL

4、ISA及icELISA技術(shù)篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞，利用小鼠腹水誘生法制備出能夠檢測(cè)胭脂紅的高特異性、親和力的單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立合適的ELISA試劑盒工作方法。
　　1.P4R完全抗原的合成及鑒定
　　胭脂紅屬于小分子半抗原，其分子結(jié)構(gòu)中并沒有可直接與蛋白進(jìn)行偶聯(lián)的羧基或氨基，因此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用鹵代羧酸法將分子上的羥基與次氯酸鈉反應(yīng)，連接上帶有羧基的間隔臂，再經(jīng)活性脂法與載體蛋白(BSA，OVA)進(jìn)行偶聯(lián)得到完全抗原

5、A;同時(shí)設(shè)計(jì)用硝酸給胭脂紅分子萘環(huán)5位引入一個(gè)硝基，然后用鈀碳和氫氣還原成氨基制得胭脂紅的衍生物，經(jīng)戊二醛兩步法與載體蛋白偶聯(lián)，得到完全抗原B。兩種完全抗原經(jīng)紫外光譜掃描和SDS-PAGE凝膠電泳鑒定均初步判定偶聯(lián)成功。利用BCA試劑盒測(cè)得P4R-BSA和P4R-OVA的蛋白濃度分別為4.65mg/mL和3.17mg/mL，P4R-NH2-BSA和P4R-NH2-OVA的蛋白濃度分別為2.87mg/mL和2.21 mg/mL。其中經(jīng)對(duì)比

6、完全抗原A較完全抗原B的偶聯(lián)效果更好，因此最終選擇完全抗原A進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
　　2.P4R單抗的制備
　　使用P4R-BSA作為免疫抗原按照常規(guī)動(dòng)物免疫方案對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，以P4R-OVA為檢測(cè)抗原對(duì)五免7d后的小鼠血清檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到1∶16000以上。利用細(xì)胞融合技術(shù)、ELISA方法和有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆并篩選出三株可持續(xù)分泌抗P4R抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6A3、6B6和7C6。利用小鼠體內(nèi)誘生

7、法制備了抗P4R單克隆抗體的腹水，其蛋白濃度為29.8mg/mL、25.1 mg/mL和24.7mg/mL;抗體效價(jià)分別為32000、32000和64000，對(duì)比發(fā)現(xiàn)腹水7C6的效果最好。采用HiTrap Protein G HP純化柱純化腹水7C6，純化后經(jīng)SDS-PAGE鑒定雜蛋白明顯減少。交叉實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該單抗與羅丹明B、副品紅、中性紅、橙黃II、檸檬黃、日落黃、莧菜紅沒有交叉反應(yīng)，而對(duì)胭脂紅的抑制率為100％。
　　3.E

8、LISA檢測(cè)方法的建立
　　利用純化后的單克隆抗體建立檢測(cè)P4R的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，抗原的最佳工作濃度為1∶800，抗體的最佳工作濃度為1∶16000，P4R濃度在5～5000ng/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，線性方程為y=0.2207x+0.0003(R2=0.9931)，IC50為172.97ng/mL，LOD低于2ng/mL，LOQ低于5ng/mL。
　　4.鮮肉中P4R添加回收試驗(yàn)
　　對(duì)鮮肉進(jìn)行添加回收試