重金屬鉛單克隆抗體的制備及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鉛對(duì)人和動(dòng)物健康的潛在危害，已日益引起人們的關(guān)注。鉛是環(huán)境污染物中毒性很大并且以神經(jīng)毒性為主的一種重金屬元素，其可通過(guò)消化道和呼吸道進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)神經(jīng)、造血、消化、心血管等系統(tǒng)和腎臟造成損害。環(huán)境鉛污染和食品、飼料鉛污染是造成人和動(dòng)物鉛損傷的主要途徑，因此，監(jiān)測(cè)環(huán)境，食品、飼料原料和食品、飼料包裝材料及食品、飼料中鉛的含量，是控制人和動(dòng)物鉛攝入量，預(yù)防和減少鉛對(duì)人和動(dòng)物危害的重要措施。
　　 重金屬離子的免疫學(xué)檢測(cè)方法是一

2、種新型、高效、快速的檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比該方法具有檢測(cè)速度快、費(fèi)用低廉、簡(jiǎn)單易攜、靈敏度高和選擇性的特點(diǎn)。且可以用于重金屬離子的快速檢測(cè)和常規(guī)檢測(cè)，在臨床醫(yī)學(xué)、動(dòng)物檢疫、食品飼料科學(xué)、藥物殘留等領(lǐng)域都有著很廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本研究采用重金屬鉛離子與雙功能螯合劑p-SCN-CHX-A＂-DTPA進(jìn)行螯合反應(yīng)，制得Pb2+-SCN-CHX-A＂-DTPA螯合物，再將Pb2+-SCN-CHX-A＂-DTPA螯合物分別與載

3、體蛋白KLH、BSA偶聯(lián)，制備免疫抗原和針對(duì)Pb2+單克隆抗體的檢測(cè)抗原。再使用雙功能螯合劑p-SCN-CHX-A＂-DTPA與載體蛋白BSA偶聯(lián)，制備檢測(cè)螯合劑的檢測(cè)抗原。
　　 選取6～8周齡BALB/c雌性小鼠4只，腹腔注射合成的免疫抗原Pb2+-SCN-CHX-A＂-DTPA-KLH，100μg/只，誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生對(duì)免疫抗原的免疫應(yīng)答，檢測(cè)其所分泌的抗體。
　　 取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)進(jìn)行融

4、合、篩選及克隆，獲得分泌抗Pb2+單抗的雜交瘤細(xì)胞株，并對(duì)細(xì)胞株所分泌的抗Pb2+單抗的亞類(lèi)、細(xì)胞株誘生的腹水單抗的濃度及單抗親和常數(shù)進(jìn)行測(cè)定。
　　 在對(duì)單抗的效價(jià)、親和力等進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，選擇單抗2A3用于建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，確定反應(yīng)系統(tǒng)最佳工作條件，并建立標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線(xiàn)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功制備了的免疫抗原Pb2+-SCN-CHX-A＂-DTPA-KLH和檢測(cè)抗原Pb2+-SCN-C

5、HX-A＂-DTPA-BSA以及針對(duì)螯合劑的檢測(cè)抗原SCN-CHX-A＂-DTPA-BSA。
　　 (2)檢測(cè)抗原作1:400稀釋(即檢測(cè)抗原濃度為2.5μg/mL)時(shí)反應(yīng)效果最佳，免疫小鼠血清效價(jià)均達(dá)1:16000以上。結(jié)果表明合成的免疫抗原Pb2+-SCN-CHX-A＂-DTPA-KLH成功誘導(dǎo)小鼠機(jī)體產(chǎn)生了對(duì)免疫抗原的免疫應(yīng)答，并分泌針對(duì)免疫抗原的特異性抗體。
　　 (3)免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0)進(jìn)

6、行融合、篩選及克隆，共得四株抗Pb2+雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1H4、1H7、2H1、2A3。四株抗Pb2+雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗體均為IgM亞類(lèi)。四株雜交瘤細(xì)胞所誘生的小鼠腹水抗體濃度分別為3.85mg/mL，4.21mg/mL，3.98mg/mL，4.08mg/mL，單抗親和常數(shù)2A3＞1H7＞2H1＞1H4，且均在108mol/L以上，單抗具有較高的親和力。由于2A3單抗親和常數(shù)最大，因此抗Pb2+的雜交瘤細(xì)胞株2A3最佳。

7、　　 (4)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳工作條件為：螯合劑DTPA的最佳工作濃度為4mM。抗原Pb2+-SCN-CHX-A＂-DTPA-BSA(1mg/mL)最佳工作濃度為0.25mg/mL;抗鉛單抗最佳工作濃度為1.02μg/mL;最佳封閉條件為10％兔血清37℃封閉1.5h;二抗最佳工作條件為5000倍稀釋(0.16μg/mL)，37℃作用1h;底物最佳作用時(shí)間為15min。在間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳工作條件下，建立了鉛離子標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)