糖化酵母葡萄糖淀粉酶基因在釀酒酵母中克隆與表達.pdf

1、當前環(huán)境惡化、資源匱乏已經(jīng)成為全球性問題，所以用乙醇作為一種新型燃料正更多的為人們所研究，開發(fā)新型的清潔能源是解決環(huán)境與資源等問題最直接有效的方式。在眾多的化石燃料中，酒精燃燒不僅清潔、可再生而且不產(chǎn)生有毒和溫室氣體。目前采用遺傳工程來構(gòu)造出能夠直接水解淀粉生成酒精的工程菌株，新型菌株可以以淀粉為原料高效生產(chǎn)酒精，并且使酒精產(chǎn)量大大提升。
　　在工業(yè)生產(chǎn)上，在以淀粉為原料生產(chǎn)葡萄糖果糖糖漿工藝中，葡萄糖淀粉酶被廣泛利用。但現(xiàn)有葡萄

2、糖淀粉酶菌株分泌表達量較低，本實驗?zāi)康氖菍⑵咸烟堑矸勖富驅(qū)氲结劸平湍钢幸詷?gòu)建一株重組的釀酒酵母菌株，重組菌株能高效表達并分泌葡萄糖淀粉酶水解淀粉。
　　實驗根據(jù)NCBI中Genebank數(shù)據(jù)庫中的序列信息，采用PCR方法從糖化酵母中提取總DNA，并擴增出葡萄糖淀粉酶基因STA1，然后將PCR產(chǎn)物連入pUM-T載體構(gòu)建成為重組質(zhì)粒pUM-T-stal，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，并進行測序，成功克隆得到STA1重組質(zhì)粒。將提取的重組

3、質(zhì)粒pUM-T-stal用BspDI和Acc65I酶切得到STA1并且轉(zhuǎn)入到釀酒酵母表達質(zhì)粒pRS416中，取名為pRS416-stal。重組質(zhì)粒pRS416-stal轉(zhuǎn)化入釀酒酵母感受態(tài)菌種中，獲得高效表達STA1工程菌。
　　通過誘導表達，重組的釀酒酵母葡萄糖淀粉酶酶活最高為120U/mL。測定葡萄糖淀粉酶酶學性質(zhì)，結(jié)果為其最適溫度為60℃，40℃～70℃下穩(wěn)定性良好;其最適pH為5，在pH為4～6之間穩(wěn)定性良好。反應(yīng)2h后酶