家蠶EST-SSR分子標(biāo)記的篩選與初步應(yīng)用.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是遺傳學(xué)上具有重要地位的模式生物，也是國(guó)際鱗翅目基因組協(xié)會(huì)確定的鱗翅目昆蟲的代表，應(yīng)用SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記技術(shù)研究家蠶遺傳多樣性，尋找具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因資源，特別是用SSR標(biāo)記構(gòu)建家蠶高密度的遺傳連鎖圖譜，定位有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因，對(duì)選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)家蠶品種具有極為重要的意義。1999年Reddy等報(bào)道了從家蠶基因組中分離出28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，用其中的15個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)1

2、3個(gè)家蠶品種進(jìn)行了多態(tài)性分析，Nagaraju等通過比較RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、SSR、ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)在家蠶中的運(yùn)用，認(rèn)為SSR最適合做家蠶連鎖圖譜，目前在家蠶中已構(gòu)建了包含518個(gè)SSR標(biāo)記，覆蓋3431.9cM的連鎖圖。常規(guī)SSR分

3、子標(biāo)記開發(fā)需要構(gòu)建基因組文庫、制備探針和分子雜交等，過程煩瑣而且開發(fā)成本較高，極大地制約了其發(fā)展和應(yīng)用，近年來，隨著EST(ExpressedSequence Tags)計(jì)劃在不同物種間的擴(kuò)展和研究?jī)?nèi)容的深入，在很多有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物中都積累了大量的EST序列，利用EST序列開發(fā)SSR標(biāo)記(即EST-SSR)成為新的研究熱點(diǎn)。EST-SSR標(biāo)記除了具有基因組SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)外，還可對(duì)決定重要表型性狀的等位基因進(jìn)行直接鑒定，主要由于其位

4、于基因的轉(zhuǎn)錄部分，與功能基因緊密連鎖；EST-SSR標(biāo)記還具有物種間通用性高的特點(diǎn)，可以應(yīng)用在一系列相關(guān)物種中。目前己在葡萄、甘蔗、小麥、黑麥、大麥、大豆、水稻、松樹以及高羊茅等植物和中國(guó)對(duì)蝦、馬氏珠母貝、蜜蜂、綿羊、鯰魚等動(dòng)物中建立了EST-SSR標(biāo)記并進(jìn)行了多方面的分析。
　　 截止2007年12月26日，NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄大約245000條家蠶EST序列，但目前這些序列中的EST-SSR的情況還未明確，更無利用這些序列

5、來建立SSR標(biāo)記的報(bào)道。本研究對(duì)現(xiàn)有家蠶第12連鎖群中的EST-SSR信息進(jìn)行全面分析，以期了解家蠶EST部分資源的特性，為利用家蠶EST建立SSR標(biāo)記和探索其在家蠶遺傳育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1)從NCBI公共數(shù)據(jù)庫獲得與家蠶12連鎖群相關(guān)的ESTs序列4465條，做聚類年拼接處理后，得到581條無冗余ESTs序列，在122條序列中共檢測(cè)到154個(gè)EST-SSR，占所研究的EST序列的2.73％，平均每3.

6、12 kb含有一個(gè)EST-SSR；三和四核苷酸重復(fù)是主導(dǎo)類型，其大部分為Perfect形式，分別占EST-SSR總數(shù)的36.36％和28.57％；EST-SSR標(biāo)記的核苷酸重復(fù)平均長(zhǎng)度約為16.2bp，最長(zhǎng)為30 bp；通過同源性比較，有86條SSR-EST沒有找到同源序列，10條不符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，其余26條SSR-EST中共含有40個(gè)SSR，14個(gè)(35.0％)位于5'-UTR，11個(gè)(27.5％)位于3'-UTR，15個(gè)(37.5％)

7、位于CDS區(qū)。
　　 2)為建立穩(wěn)定的家蠶EST-SSR標(biāo)記技術(shù)體系，本實(shí)驗(yàn)采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化篩選了影響家蠶EST-SSR的主要PCR因素，建立了最佳的反應(yīng)體系，在15μL反應(yīng)體系中，包含2.0 mmol/LM2+，60 ng模板DNA，0.30 mmol/LdNTPs，0.50μmol/L引物及1.0U Taq酶，并通過梯度PCR實(shí)驗(yàn)篩選得到相應(yīng)引物的最佳退火溫度。以該體系為基礎(chǔ)，應(yīng)用EST-SSR引物擴(kuò)增8

8、個(gè)家蠶的基因組DNA，擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，聚類分析結(jié)果能較好地反映供試家蠶的地理來源關(guān)系。以0.5的相似性為分割點(diǎn)，8個(gè)家蠶可分成2大類群，類群Ⅰ主要由中國(guó)系統(tǒng)家蠶組成，類群Ⅱ由日本系統(tǒng)家蠶組成。該研究為EST-SSR標(biāo)記技術(shù)在家蠶分子生物學(xué)研究方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 3)采用回交法把顯性耐氟主效基因?qū)氲叫誀顑?yōu)良的家蠶夏芳中可以提高其后代的耐氟性，利用前期獲得的與家蠶耐氟基因緊密連鎖的EST-SSR標(biāo)記NS1201，在回交