菠蘿SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及初步應(yīng)用.pdf

1、菠蘿(Ananas comosus L.Merr.)是多年生常綠草本,與香蕉、椰子、芒果并稱為四大熱帶名果。在長(zhǎng)期自然進(jìn)化和人工栽培馴化過(guò)程中形成了許多品種、變種和類型。長(zhǎng)期以來(lái),菠蘿的分類方法中標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、導(dǎo)致地區(qū)及國(guó)際間的菠蘿種質(zhì)頻繁交流中出現(xiàn)同名異物、同物異名現(xiàn)象,影響菠蘿種質(zhì)資源的合理利用和菠蘿的品種改良與推廣。
　　 本試驗(yàn)開(kāi)發(fā)菠蘿簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple Sequence Repeat,SSR)標(biāo)記,旨在為菠蘿品種

2、鑒定、群體遺傳、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇育種等工作奠定基礎(chǔ)。其主要研究結(jié)果如下:
　　 1、從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到菠蘿EST序列5660條(截止2008年12月1日),其中含有SSR重復(fù)位點(diǎn)的序列1110條,開(kāi)發(fā)出EST-SSR引物190對(duì)。菠蘿轉(zhuǎn)錄子組中無(wú)冗余EST-SSRs的分布頻率約1SSR/3.73kb,多數(shù)都是較小的重復(fù)單元,二核苷酸重復(fù)占主導(dǎo),其中AG/CT(83.5％)是二核苷酸重復(fù)中含量最豐富的位點(diǎn)

3、;隨機(jī)選取的30對(duì)引物擴(kuò)增后,得到26個(gè)有效擴(kuò)增的SSR標(biāo)記?；诰垲惙治龊拖底V分析相吻合的結(jié)果表明,開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記可以用于對(duì)菠蘿遺傳多樣性的評(píng)價(jià)。
　　 2、運(yùn)用SAM法開(kāi)發(fā)基因組SSR標(biāo)記,挑選到99個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序,測(cè)得序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找后,發(fā)現(xiàn)有86個(gè)序列包含有SSR位點(diǎn)。用stackPACK v2.2聚類分析后,得到68條單個(gè)序列,8組重復(fù)序列,表明只有76條序列能用來(lái)設(shè)計(jì)引物。挑選適合設(shè)計(jì)引物的36條DN

4、A序列設(shè)計(jì)了36對(duì)特異引物;其中,24對(duì)引物得到了有效擴(kuò)增,又有13對(duì)引物在16個(gè)不同的菠蘿種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性。PstI SAM引物和5'錨定引物PAC/PGT的組合開(kāi)發(fā)得到44個(gè)序列,PstI SAM引物和5'錨定引物PCT/PGA的組合開(kāi)發(fā)得到55個(gè)序列,表明在菠蘿基因組中,CT/GA比AC/GT豐富。
　　 3、用開(kāi)發(fā)的18個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)48份材料進(jìn)行遺傳多樣性分析,聚類結(jié)果表明在相似系數(shù)0.66處可劃分為四個(gè)類群:第一類

5、群是以Riply Queen為代表的25個(gè)品種,第二類群是無(wú)刺卡因代表的20個(gè)品種,第三類群只有2000sh2和金菠蘿2個(gè)品種,第四類群只有屬于西班牙類的紅西班牙一個(gè)品種;結(jié)果與形態(tài)分類基本一致。挑選五個(gè)標(biāo)記對(duì)10份材料進(jìn)行擴(kuò)增、回收及測(cè)序,結(jié)果顯示,不同標(biāo)記都擴(kuò)增到了相應(yīng)的重復(fù)位點(diǎn)序列,位點(diǎn)變異主要是由SSR重復(fù)次數(shù)和側(cè)翼序列的堿基突變引起。
　　 4、應(yīng)用5個(gè)SSR標(biāo)記初步構(gòu)建了31份菠蘿種質(zhì)的指紋圖譜。為下一步系統(tǒng)構(gòu)建菠蘿