大白菜抗蕪菁花葉病毒病基因的SSR分子標(biāo)記的研究.pdf

1、大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)原產(chǎn)于我國(guó)，是我國(guó)最重要的蔬菜作物之一。但是五十年代以來(lái)，由于病毒病的普遍流行，大白菜的生產(chǎn)遭受了巨大損失，病毒病成為大白菜的三大病害之一。研究表明，TuMV是大白菜病毒病的主要病原，占病毒分離物的71.9％。因此抗TuMV病毒病已成為我國(guó)目前大白菜抗病育種的主要目標(biāo)，用傳統(tǒng)的田間抗性接種鑒定法篩選抗性植株程序繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且準(zhǔn)確度不高，難以適應(yīng)生產(chǎn)的需要。因此尋找

2、與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種，將會(huì)大大加快白菜抗病育種的進(jìn)程。
　　 本研究選用兩個(gè)抗病材料(國(guó)家級(jí)抗源“8407”和高抗TuMV的高代自交系材料“73”)和兩個(gè)感病材料（高感TuMV的自交系材料“71-36-2”和感病的大白菜核心種質(zhì)材料“冠291”）為引物初篩模板。利用“71-36-2”和“73”雜交后自交所形成的F2代分離群體為試材進(jìn)行遺傳分析和測(cè)算標(biāo)記連鎖距離。對(duì)166個(gè)F2代單株人工接種TuMV-

3、C4后，用生物學(xué)觀察和酶聯(lián)免疫檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)植株進(jìn)行TuMV抗性鑒定。采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選與大白菜抗TuMV基因相連鎖的分子標(biāo)記，主要結(jié)果如下:
　　 1.經(jīng)過(guò)抗病性鑒定，在F2代分離群體中抗病單株和感病單株的比例為1∶3.15，x2測(cè)驗(yàn)表明，抗感分離比例符合1∶3的分離比例，表明在該群體中對(duì)TuMV-C4的抗性受隱性單基因控制。
　　 2.通過(guò)L16(44)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了適合大白菜EST-SSR

4、反應(yīng)的最佳PCR反應(yīng)體系，結(jié)果表明:各因素不同水平濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果均有一定影響，其中，以引物濃度影響最大，其次是dNTP和Taq DNA聚合酶，模板DNA濃度的影響最小。優(yōu)化后的最佳體系（20μL）為:引物濃度1.0μmol·L-1，dNTPs0.25 mmol·L-1，Taq酶0.5U，模板DNA70ng。
　　 3.從公共數(shù)據(jù)庫(kù)搜索大白菜EST序列2566條，利用SSRIT軟件篩選SSR，共篩選出313條SSR-ESTs，含S

5、SR365個(gè)。根據(jù)SSR兩翼的序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物135對(duì)，用于EST-SSR分子標(biāo)記篩選。
　　 4.利用上述引物，篩選與大白菜TuMV抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記。結(jié)果表明，利用引物HCC259擴(kuò)增出一條與抗TuMV基因連鎖距離只有3.8cM且呈共顯性的標(biāo)記條帶，這是目前首個(gè)與大白菜TuMV抗性位點(diǎn)連鎖距離在5.0以下且呈共顯性的分子標(biāo)記，較以往的標(biāo)記更有應(yīng)用價(jià)值。
　　 5.標(biāo)記的適用性研究結(jié)果表明，