副溶血弧菌絲氨酸蛋白酶及溶血素的表達(dá)、純化、定點(diǎn)突變及弧菌多聯(lián)DNA疫苗的研制.pdf

1、弧菌病是海水養(yǎng)殖動(dòng)物最嚴(yán)重的細(xì)菌性病害之一,其中副溶血弧菌是魚蝦貝類的主要弧菌病原,也是人類食物中毒的主要病原菌。
　　 從致病性副溶血弧菌FYZ8621.4基因組中克隆了絲氨酸蛋白酶基因(vps)。其由1779 bp組成,編碼含592個(gè)氨基酸的多肽,連接到pET-28a(+)中構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)/vps,并在夫腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)的絲氨酸蛋白酶經(jīng)Ni瓊脂糖親和柱純化后,SDS-PAGE分析其分

2、子量為63 kDa。酶的最適pH為8.0,最適反應(yīng)溫度為37℃。利用PCR方法對(duì)絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變(Asp51-Asn,His89-Asp,Ser318-Ala,Ser318-Leu,Ser318-Pro),結(jié)果突變蛋白全部或部分的喪失了蛋白酶活性。將絲氨酸蛋白酶的突變基因vps(Ser318-Pro)與真核表達(dá)載體pEGFP-N1連接,構(gòu)建DNA疫苗pEGFP-N1/m-vps。分別用10μg和50μg的pEGF

3、P-N1/m-vps對(duì)大菱鲆進(jìn)行肌肉注射免疫,免疫1周后能在魚的肌肉組織檢測到外源蛋白的表達(dá),并在魚的血清中檢測到特異性抗體,4周后的抗體效價(jià)分別為1:512和1:1,024。DNA疫苗對(duì)大菱鲆的免疫保護(hù)率分別為80.55％和96.11％,具有顯著保護(hù)作用(P＜0.05)。
　　 從副溶血弧菌FYZ8621.4基因組中克隆了熱穩(wěn)定直接溶血素TDH2單體的基因(tdh2)。其由570bp組成,編碼含189個(gè)氨基酸的多肽,連接到pE

4、T-28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)/tdh2,并在BL21(DE3)中表達(dá)。表達(dá)的TDH2經(jīng)Ni柱純化后,SDS-PAGE分析其分子量為21 kDa。利用PCR方法對(duì)tdh2中與溶血作用相關(guān)的兩個(gè)氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變(Gly62-Ser,Trp65-Ala),突變的蛋白完全喪失了溶血活性。將熱穩(wěn)定直接溶血素的突變基因tdh2(Trp65-Ala)與pEGFP-N1連接,構(gòu)建DNA疫苗pEGFP-N1/m-tdh2。分別用1

5、0μg和50μg的pEGFP-N1/m-tdh2對(duì)大菱鲆進(jìn)行肌肉注射免疫,免疫1周后在魚的肌肉組織檢測到外源蛋白的表達(dá),并在魚的血清中檢測到特異性抗體,4周后抗體效價(jià)分別為1:4,096和1:8,192。DNA疫苗對(duì)大菱鲆的免疫保護(hù)率分別為92.22％和100％(P＜0.05)。
　　 將副溶血弧菌的tdh2基因和vps基因先后連接到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中構(gòu)建融合基因tdh2-vps。重組質(zhì)粒pET-28a(+)/t

6、dh2-vps在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白TDH2-VPS經(jīng)Ni柱純化后,SDS-PAGE分析其分子量為85 kDa。將融合基因tdh2-vps與pEGFP-N1進(jìn)行連接,構(gòu)建二價(jià)DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-vps。分別用10μg和50μg的pEGFP-N1/tdh2-vsp對(duì)大菱鲆進(jìn)行肌肉注射免疫,免疫1周后能在魚的肌肉組織檢測到外源蛋白的表達(dá),并在魚的血清中檢測到特異性抗體,4周后抗體效價(jià)分別為1:1

7、,024和1:2,048。DNA疫苗對(duì)大菱鲆的免疫保護(hù)率分別為96.11％和100％(P＜0.05)。
　　 將副溶血弧菌tdh2基因和哈維氏弧菌oppA基因連接到pET-28a(+)構(gòu)建融合基因tdh2-oppA。重組質(zhì)粒pET-28a(+)/tdh2-oppA在BL21(DE3)中表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白TDH2-OppA經(jīng)Ni柱純化后,SDS-PAGE分析其分子量為84 kDa。將融合基因tdh2-oppA與pEGFP-N1進(jìn)

8、行連接,構(gòu)建二聯(lián)DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-oppA。分別用10μg和50μg的pEGFP-N1/tdh2-oppA對(duì)大菱鲆進(jìn)行肌肉注射免疫,免疫1周后在魚的肌肉組織檢測到外源蛋白的表達(dá),并在魚的血清中檢測到特異性抗體,4周后抗體效價(jià)分別為1:512和1:2,048。DNA疫苗對(duì)副溶血弧菌感染大菱鲆的免疫保護(hù)率均為100％;對(duì)哈維氏弧菌感染大菱鲆的免疫保護(hù)率分別為40％和60％(P＜0.05)。
　　 將副溶血弧菌td

9、h2基因和鰻弧菌ompU基因連接到pET-28a(+)中構(gòu)建融合基因tdh2-ompU。重組質(zhì)粒pET-28a(+)/tdh2-ompU在BL21(DE3)中麥達(dá)。表達(dá)的融合蛋白TDH2-OmpU經(jīng)Ni柱純化后,SDS-PAGE分析其分子量為57 kDa。將融合基因tdh2-oppA與pEGFP-N1進(jìn)行連接,構(gòu)建二聯(lián)DNA疫苗pEGFP-N1/tdh2-ompU。分別用10μg和50μg的pEGFP-N1/tdh2-ompU對(duì)大菱鲆進(jìn)