哈維氏弧菌VHH溶血素作用機理的研究.pdf

1、隨著水產養(yǎng)殖業(yè)近年來的迅速發(fā)展，海水養(yǎng)殖動物的細菌性病害造成了巨大的經濟損失。由弧菌屬細菌(Vibrio spp．)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地魚、蝦、貝類等海水養(yǎng)殖動物中普遍流行、危害最大的細菌性疾病之一?；【呛Ｑ蟓h(huán)境中常見細菌類群之一，廣泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的體表與腸道中，是海水和許多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，約20種是海水養(yǎng)殖動物的病原菌。哈維氏弧菌作為一種重要的海水養(yǎng)殖動物病原弧菌，其危

2、害日益顯現。哈維氏弧菌的致病機理還不清楚。 在哈維氏弧菌可能的毒力因子中，VHH溶血素--一種副溶血弧菌TLH類的溶血素，被認為與哈維氏弧菌對魚的致病性密切相關。本研究以氣相色譜技術檢測哈維氏弧菌VHH溶血素磷脂酶水解磷脂酰膽堿的產物，確定了其磷脂酶活性的類型：VHH既有磷脂酶A1活性，又有磷脂酶A2活性，是一種磷脂酶B。對重組的VHH溶血素進行化學修飾，發(fā)現組氨酸和二硫鍵修飾試劑抑制了VHH的磷脂酶活性，說明其磷脂酶催化中心可

3、能含有組氨酸殘基，并且其構象的穩(wěn)定性依賴于半胱氨酸形成的二硫鍵。以生物信息學手段查明了VHH磷脂酶活性中心的位點，并對其中的關鍵氨基酸殘基--絲氨酸153進行了點突變，將其替換成無催化作用的甘氨酸殘基，在大腸桿菌表達重組突變蛋白S153G，并以鎳一瓊脂糖樹脂親和層析純化了該蛋白；突變的VHH溶血素S1536失去了磷脂酶活性、溶血活性和對大菱鲆的致病性，說明VHH溶血素的溶血活性和對魚類的致病性由其磷脂酶活性賦予。對VHH溶血素N端可能的

4、類lipocalin結構域的三個關鍵氨基酸殘基分別進行了突變以瓦解其三級結構，突變的VHH溶血素均失去了磷脂酶活性，說明VHH溶血素N端的可能結構域對于VHH溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。對VHH溶血素的C端磷脂酶結構域進行了同源建模，并以所得模型與VHH溶血素的底物磷脂酰膽堿進行分子拼接，查明了VHH溶血素在催化狀態(tài)下與底物結合的可能位點，并對這些氨基酸殘基分別進行了定點突變。其中，色氨酸174是VHH溶血素與底物的膽堿基團結合的位

5、點，對這一氨基酸殘基的突變，導致突變蛋白W174A失去了磷脂酶活性，說明色氨酸174可能是VHH溶血素在催化狀態(tài)下與底物結合的關鍵位點。以Southern雜交技術檢測了vhh溶血素基因在VIB645菌株基因組的分布，結果表明在其染色體和質粒上各有一個vhh溶血素基因。本研究促進了對哈維氏弧菌致病機制的深入理解，填補了對弧菌TLH/VHH類溶血素作用機理認識上的空白，并對促進包括基因工程疫苗在內的環(huán)境友好型的哈維氏弧菌病害防治技術有重要的