哈維氏弧菌VHH溶血素作用機(jī)理的研究.pdf

1、隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)近年來(lái)的迅速發(fā)展，海水養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性病害造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由弧菌屬細(xì)菌(Vibrio spp．)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地魚(yú)、蝦、貝類等海水養(yǎng)殖動(dòng)物中普遍流行、危害最大的細(xì)菌性疾病之一。弧菌是海洋環(huán)境中常見(jiàn)細(xì)菌類群之一，廣泛分布在近岸及河口海水、海洋生物的體表與腸道中，是海水和許多海洋生物的正常菌群。在已知的弧菌中，約20種是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病原菌。哈維氏弧菌作為一種重要的海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原弧菌，其危

2、害日益顯現(xiàn)。哈維氏弧菌的致病機(jī)理還不清楚。 在哈維氏弧菌可能的毒力因子中，VHH溶血素--一種副溶血弧菌TLH類的溶血素，被認(rèn)為與哈維氏弧菌對(duì)魚(yú)的致病性密切相關(guān)。本研究以氣相色譜技術(shù)檢測(cè)哈維氏弧菌VHH溶血素磷脂酶水解磷脂酰膽堿的產(chǎn)物，確定了其磷脂酶活性的類型：VHH既有磷脂酶A1活性，又有磷脂酶A2活性，是一種磷脂酶B。對(duì)重組的VHH溶血素進(jìn)行化學(xué)修飾，發(fā)現(xiàn)組氨酸和二硫鍵修飾試劑抑制了VHH的磷脂酶活性，說(shuō)明其磷脂酶催化中心可

3、能含有組氨酸殘基，并且其構(gòu)象的穩(wěn)定性依賴于半胱氨酸形成的二硫鍵。以生物信息學(xué)手段查明了VHH磷脂酶活性中心的位點(diǎn)，并對(duì)其中的關(guān)鍵氨基酸殘基--絲氨酸153進(jìn)行了點(diǎn)突變，將其替換成無(wú)催化作用的甘氨酸殘基，在大腸桿菌表達(dá)重組突變蛋白S153G，并以鎳一瓊脂糖樹(shù)脂親和層析純化了該蛋白；突變的VHH溶血素S1536失去了磷脂酶活性、溶血活性和對(duì)大菱鲆的致病性，說(shuō)明VHH溶血素的溶血活性和對(duì)魚(yú)類的致病性由其磷脂酶活性賦予。對(duì)VHH溶血素N端可能的

4、類lipocalin結(jié)構(gòu)域的三個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基分別進(jìn)行了突變以瓦解其三級(jí)結(jié)構(gòu)，突變的VHH溶血素均失去了磷脂酶活性，說(shuō)明VHH溶血素N端的可能結(jié)構(gòu)域?qū)τ赩HH溶血素行使其磷脂酶功能是必需的。對(duì)VHH溶血素的C端磷脂酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了同源建模，并以所得模型與VHH溶血素的底物磷脂酰膽堿進(jìn)行分子拼接，查明了VHH溶血素在催化狀態(tài)下與底物結(jié)合的可能位點(diǎn)，并對(duì)這些氨基酸殘基分別進(jìn)行了定點(diǎn)突變。其中，色氨酸174是VHH溶血素與底物的膽堿基團(tuán)結(jié)合的位

5、點(diǎn)，對(duì)這一氨基酸殘基的突變，導(dǎo)致突變蛋白W174A失去了磷脂酶活性，說(shuō)明色氨酸174可能是VHH溶血素在催化狀態(tài)下與底物結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。以Southern雜交技術(shù)檢測(cè)了vhh溶血素基因在VIB645菌株基因組的分布，結(jié)果表明在其染色體和質(zhì)粒上各有一個(gè)vhh溶血素基因。本研究促進(jìn)了對(duì)哈維氏弧菌致病機(jī)制的深入理解，填補(bǔ)了對(duì)弧菌TLH/VHH類溶血素作用機(jī)理認(rèn)識(shí)上的空白，并對(duì)促進(jìn)包括基因工程疫苗在內(nèi)的環(huán)境友好型的哈維氏弧菌病害防治技術(shù)有重要的