創(chuàng)傷弧菌溶血素基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)和鑒定.pdf

1、目的：創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)自然存在于近海和海灣的海水和海底沉積物中，屬低度嗜鹽菌。人通過(guò)進(jìn)食生的牡蠣，經(jīng)胃腸道粘膜或破損的皮膚接觸海水而感染創(chuàng)傷弧菌。創(chuàng)傷弧菌感染后病情發(fā)展迅速，最終發(fā)展為感染性休克、多器官衰竭而死亡，死亡率高達(dá)70％。創(chuàng)傷弧菌的致病性與許多毒力因子有關(guān)，包括溶血素、脂多糖、莢膜多糖、彈性組織蛋白激酶和金屬蛋白激酶等。研究發(fā)現(xiàn)胞外溶血素基因(Vibrio vulnificus cytoly

2、sin，vvc)是重要的致病因子之一，參與了細(xì)菌入侵宿主的毒力機(jī)制。本文通過(guò)構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌溶血素基因(vvc)的融合表達(dá)載體，并實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌溶血素在大腸桿菌中的高效表達(dá)，為今后的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。 方法：根據(jù)GenBank公布的創(chuàng)傷弧菌vvc基因核苷酸序列自行設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，并在5’-端與3’-端分別增加BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，應(yīng)用PCR技術(shù)從一株創(chuàng)傷弧菌基因組中擴(kuò)增了vvc基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切

3、回收后，定向插入pET-32a(+)原核表達(dá)載體，提取pET32a(+)-vvc重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切并測(cè)序，將測(cè)定結(jié)果與GenBank中已報(bào)道的序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果正確后將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于E.coli BL21(DE3)工程菌株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物行SDS-PAGE并進(jìn)行Westernblot鑒定。 結(jié)論：從創(chuàng)傷弧菌的總DNA中克隆了胞外蛋白vvc基因，成功地構(gòu)建了pET32a(+)-vvc重組質(zhì)粒，并在大腸桿