運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)豬免疫機(jī)能的影響及其調(diào)控機(jī)理初探.pdf

1、近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的不斷提高，豬的長(zhǎng)途運(yùn)輸也越來(lái)越普遍，隨之而來(lái)的是運(yùn)輸應(yīng)激給豬帶來(lái)的一系列不良影響，比如運(yùn)輸途中豬的猝死。研究表明，豬在運(yùn)輸途中的死亡直接與運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)其免疫功能的抑制有關(guān)。通過(guò)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的作用，應(yīng)激能夠影響動(dòng)物免疫系統(tǒng)的機(jī)能。本實(shí)驗(yàn)將從細(xì)胞因子的角度探討運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)豬免疫機(jī)能的影響及其調(diào)控機(jī)理。
　　 試驗(yàn)將在相同環(huán)境中飼養(yǎng)的19頭皮特蘭和二花臉雜交二代豬（體重：50±2kg,飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)

2、科院）隨機(jī)分為A～D4組。試驗(yàn)當(dāng)日，對(duì)照組豬（A組，4頭）處于正常飼養(yǎng)環(huán)境，運(yùn)輸組（均為5頭）早上7；00開始運(yùn)輸，并分裝在2個(gè)獨(dú)立的木制箱子中，每箱分別為2頭和3頭，然后用動(dòng)物運(yùn)輸車輛分別進(jìn)行1h（B組）、2h(C組)和4h（D組）的運(yùn)輸應(yīng)激，路途運(yùn)輸模擬國(guó)內(nèi)普通等級(jí)公路的運(yùn)輸狀況（當(dāng)時(shí)室外溫度為18～25℃），速度控制在30～40km.h-1，整個(gè)過(guò)程沒(méi)有飲水和喂食。對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激到試驗(yàn)設(shè)定時(shí)間的試驗(yàn)豬進(jìn)行及時(shí)剖殺，采取血液，分離血清用

3、于淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化的定量檢測(cè)；采取腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和胸腺組織各一份，固定于4％多聚甲醛，用于NF-κB激光掃描共聚焦顯微鏡的定位檢測(cè)；同樣取兩份組織樣品用液氮速凍后，凍存于-80℃冰箱，用于P38MAPK和細(xì)胞因子mRNA的定量檢測(cè)；探討運(yùn)輸應(yīng)激豬外周血淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、血清中細(xì)胞因子含量及免疫器官中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性，找出運(yùn)輸應(yīng)激過(guò)程中影響免疫機(jī)能的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，并初步了解它的調(diào)控機(jī)制。
　　

4、 為了總體評(píng)價(jià)運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)豬體液免疫和細(xì)胞免疫功能的影響，將不同運(yùn)輸時(shí)間的豬血清稀釋后單獨(dú)或與植物血凝素A(PHA)和脂多糖(LPS)分別刺激正常豬外周血淋巴細(xì)胞，用噻唑藍(lán)(MTT)比色分析法分別檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，結(jié)果表明：運(yùn)輸1h豬血清在1:16,1:32和1:64稀釋時(shí)均能提高正常豬外周血淋巴細(xì)胞增殖率，且達(dá)到峰值，但與對(duì)照組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；隨后淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力開始下降，到4h時(shí)降到最低，且和運(yùn)輸1h相比呈顯

5、著下降（P＜0.05）。對(duì)于同一種稀釋度的血清，加入PHA和LPS后都能顯著的增強(qiáng)正常豬外周血T、B淋巴細(xì)胞的增殖活性（P＜0.01）；相對(duì)于對(duì)照組，1:32稀釋的血清和PHA共同作用，在運(yùn)輸1h時(shí)可顯著增強(qiáng)外周血T淋巴細(xì)胞的增殖活性(P＜0.05)，其余運(yùn)輸不同時(shí)間段的不同稀釋度的血清和對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異；對(duì)于不同的運(yùn)輸時(shí)間，均是在運(yùn)輸1h時(shí)T淋巴細(xì)胞的增殖活性最強(qiáng)，達(dá)到最大值，然后迅速下降，到4h時(shí)降到對(duì)照組值之下，且1:16和

6、1:32兩種稀釋血清運(yùn)輸1h組和4h組之間均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。相對(duì)于對(duì)照組，1:32稀釋運(yùn)輸1h的血清和LPS共同作用時(shí)可顯著的增強(qiáng)外周血B淋巴細(xì)胞的增殖活性(P＜0.05)。1:16和1:64兩種稀釋度血清在運(yùn)輸前后和運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖均無(wú)顯著性影響。
　　 為了探討運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)豬血清T、B淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)影響的機(jī)理，用ELISA方法分別檢測(cè)試驗(yàn)豬血清中IL-iβ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及

7、TNF-a含量的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果顯示：血清中IL-2、IL-6、IL-10的含量變化均是在運(yùn)輸后1h時(shí)達(dá)到最高，隨后開始下降但仍然高于對(duì)照組，并在4h時(shí)降到最低。其中IL-6、IL-10在4h時(shí)和對(duì)照組相比呈極顯著的下降(P＜0.01),IL-2在4h和1h相比也呈現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05），IL-iβ、IL-4及TNF-a三種細(xì)胞因子含量運(yùn)輸前后和運(yùn)輸過(guò)程中均沒(méi)有顯著性的變化。提示運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫均有影響，即Th1和Th2

8、類細(xì)胞因子均有明顯的應(yīng)答反應(yīng)，運(yùn)輸應(yīng)激過(guò)程中豬免疫機(jī)能狀態(tài)取決于二者的動(dòng)態(tài)平衡。
　　 為了解在運(yùn)輸應(yīng)激血清中變化顯著的三種細(xì)胞因子(IL-2、IL-6和IL-10)動(dòng)態(tài)變化的機(jī)理，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激豬3種主要免疫器官（腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和胸腺）中IL-2、IL-6和IL-10及其相應(yīng)受體mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：經(jīng)1h、2h和4h的運(yùn)輸應(yīng)激后，腸系膜淋巴結(jié)中三種細(xì)胞因子的表達(dá)在運(yùn)輸前后和運(yùn)輸

9、過(guò)程中均發(fā)生了顯著的變化，且均是4h時(shí)達(dá)到最大值，并顯著的高于對(duì)照組、1h組和2h組(P＜0.01)；受體mRNA也發(fā)生了顯著變化，但趨勢(shì)和細(xì)胞因子的表達(dá)不盡相同；脾臟中IL-10mRNA、IL-6mRNA、IL-6RmRNA及IL-10RmRNA的表達(dá)亦發(fā)生了顯著的變化；在胸腺中，除了IL-6RmRNA外，三種細(xì)胞因子mRNA及IL-2RmRNA,IL-10RmRNA在運(yùn)輸前后和過(guò)程中均有顯著變化。因此，豬在運(yùn)輸應(yīng)激過(guò)程中，不同免疫器

10、官細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)不盡相同，而血清中細(xì)胞因子含量的變化是三種免疫器官共同調(diào)控的結(jié)果。
　　 為找到運(yùn)輸應(yīng)激過(guò)程中導(dǎo)致豬免疫機(jī)能變化的主要調(diào)節(jié)物，使用SPASS分析軟件中的單尾分析法對(duì)淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)及血清中細(xì)胞因子含量以及與各免疫器官中細(xì)胞因子及受體表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行皮爾森相關(guān)系數(shù)分析。結(jié)果顯示：豬血清中IL-6含量的變化與運(yùn)輸豬血清1:32稀釋時(shí)T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的相關(guān)系數(shù)分別為0.823和0.764，血清中IL-10

11、含量的變化與運(yùn)輸豬血清1:32稀釋時(shí)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的相關(guān)系數(shù)為0.789，且統(tǒng)計(jì)學(xué)上均呈現(xiàn)極顯著的差異（P＜0.01）。在腸系膜淋巴結(jié)中，IL-6mRNA水平與血清中IL-10含量呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.719,P=0.004），IL-2mRNA的表達(dá)也與血清中IL-10含量呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.720，P=0.004)；在脾臟中，IL-6mRNA水平與血清IL-6含量又明顯正相關(guān)（r=0.669，P=0.009），且IL-6mRN

12、A的表達(dá)和血清中的IL-10也存在明顯的正相關(guān)(r=0.663，P=0.009)；在胸腺中，IL-10mRNA和IL-10RmRNA水平與血清中IL-10含量分別呈明顯正相關(guān)(r=0.712,P=0.000),IL-6mRNA的表達(dá)和IL-2mRNA也存在明顯的正相關(guān)(r=0.768,P=0.000)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：IL-6可作為豬運(yùn)輸后免疫功能變化的標(biāo)志物，且胸腺和脾臟分別是調(diào)節(jié)IL-10和IL-6的重要免疫器官，而腸系膜淋巴結(jié)則對(duì)

13、IL-10起負(fù)反饋的調(diào)節(jié)作用。
　　 為探討豬運(yùn)輸應(yīng)激過(guò)程中免疫器官對(duì)各種細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控，運(yùn)用ELISA方法對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激豬腸系膜淋巴結(jié)、脾臟和胸腺細(xì)胞中P38MAPK進(jìn)行定量檢測(cè)，運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)NF-κB在三種免疫器官中進(jìn)行表達(dá)和定位的檢測(cè)。結(jié)果顯示：胸腺中，P38MAPK的表達(dá)在運(yùn)輸后2h顯著高于1h組、4h組和對(duì)照組（P＜0.05）：腸系膜淋巴結(jié)和脾臟運(yùn)輸前后和過(guò)程中P38MAPK的表達(dá)均沒(méi)有發(fā)生顯著的變化。三

14、種免疫器官中的NF-κB，在運(yùn)輸前后的胞漿和胞核中均有分布，但分布率不盡相同，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，4h時(shí)達(dá)到最大值；NF-κB的入核率也隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，運(yùn)輸后4h達(dá)到最大值，與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化趨勢(shì)相同。上述結(jié)果表明，P38MAPK-NF-κB是豬運(yùn)輸應(yīng)激過(guò)程中調(diào)控免疫器官細(xì)胞因子表達(dá)的重要信號(hào)系統(tǒng)。
　　 以上試驗(yàn)研究結(jié)果表明：運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)豬免疫機(jī)能的影響存在時(shí)間效應(yīng)，運(yùn)輸1h、2h可使免疫機(jī)能代償性