運輸應激對豬免疫機能的影響及其調控機理初探.pdf

1、近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的不斷提高，豬的長途運輸也越來越普遍，隨之而來的是運輸應激給豬帶來的一系列不良影響，比如運輸途中豬的猝死。研究表明，豬在運輸途中的死亡直接與運輸應激對其免疫功能的抑制有關。通過神經(jīng)-內分泌-免疫網(wǎng)絡的作用，應激能夠影響動物免疫系統(tǒng)的機能。本實驗將從細胞因子的角度探討運輸應激對豬免疫機能的影響及其調控機理。
　　 試驗將在相同環(huán)境中飼養(yǎng)的19頭皮特蘭和二花臉雜交二代豬（體重：50±2kg,飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)

2、科院）隨機分為A～D4組。試驗當日，對照組豬（A組，4頭）處于正常飼養(yǎng)環(huán)境，運輸組（均為5頭）早上7；00開始運輸，并分裝在2個獨立的木制箱子中，每箱分別為2頭和3頭，然后用動物運輸車輛分別進行1h（B組）、2h(C組)和4h（D組）的運輸應激，路途運輸模擬國內普通等級公路的運輸狀況（當時室外溫度為18～25℃），速度控制在30～40km.h-1，整個過程沒有飲水和喂食。對運輸應激到試驗設定時間的試驗豬進行及時剖殺，采取血液，分離血清用

3、于淋巴細胞增殖指數(shù)和細胞因子動態(tài)變化的定量檢測；采取腸系膜淋巴結、脾臟和胸腺組織各一份，固定于4％多聚甲醛，用于NF-κB激光掃描共聚焦顯微鏡的定位檢測；同樣取兩份組織樣品用液氮速凍后，凍存于-80℃冰箱，用于P38MAPK和細胞因子mRNA的定量檢測；探討運輸應激豬外周血淋巴細胞增殖指數(shù)、血清中細胞因子含量及免疫器官中細胞因子mRNA表達之間的相關性，找出運輸應激過程中影響免疫機能的關鍵性細胞因子，并初步了解它的調控機制。
　　

4、 為了總體評價運輸應激對豬體液免疫和細胞免疫功能的影響，將不同運輸時間的豬血清稀釋后單獨或與植物血凝素A(PHA)和脂多糖(LPS)分別刺激正常豬外周血淋巴細胞，用噻唑藍(MTT)比色分析法分別檢測淋巴細胞增殖指數(shù)，結果表明：運輸1h豬血清在1:16,1:32和1:64稀釋時均能提高正常豬外周血淋巴細胞增殖率，且達到峰值，但與對照組比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；隨后淋巴細胞轉化能力開始下降，到4h時降到最低，且和運輸1h相比呈顯

5、著下降（P＜0.05）。對于同一種稀釋度的血清，加入PHA和LPS后都能顯著的增強正常豬外周血T、B淋巴細胞的增殖活性（P＜0.01）；相對于對照組，1:32稀釋的血清和PHA共同作用，在運輸1h時可顯著增強外周血T淋巴細胞的增殖活性(P＜0.05)，其余運輸不同時間段的不同稀釋度的血清和對照組相比無顯著性差異；對于不同的運輸時間，均是在運輸1h時T淋巴細胞的增殖活性最強，達到最大值，然后迅速下降，到4h時降到對照組值之下，且1:16和

6、1:32兩種稀釋血清運輸1h組和4h組之間均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。相對于對照組，1:32稀釋運輸1h的血清和LPS共同作用時可顯著的增強外周血B淋巴細胞的增殖活性(P＜0.05)。1:16和1:64兩種稀釋度血清在運輸前后和運輸過程中對B淋巴細胞增殖均無顯著性影響。
　　 為了探討運輸應激對豬血清T、B淋巴細胞增殖效應影響的機理，用ELISA方法分別檢測試驗豬血清中IL-iβ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及

7、TNF-a含量的動態(tài)變化，結果顯示：血清中IL-2、IL-6、IL-10的含量變化均是在運輸后1h時達到最高，隨后開始下降但仍然高于對照組，并在4h時降到最低。其中IL-6、IL-10在4h時和對照組相比呈極顯著的下降(P＜0.01),IL-2在4h和1h相比也呈現(xiàn)顯著性下降（P＜0.05），IL-iβ、IL-4及TNF-a三種細胞因子含量運輸前后和運輸過程中均沒有顯著性的變化。提示運輸應激對體液免疫和細胞免疫均有影響，即Th1和Th2

8、類細胞因子均有明顯的應答反應，運輸應激過程中豬免疫機能狀態(tài)取決于二者的動態(tài)平衡。
　　 為了解在運輸應激血清中變化顯著的三種細胞因子(IL-2、IL-6和IL-10)動態(tài)變化的機理，利用實時熒光定量RT-PCR技術，對運輸應激豬3種主要免疫器官（腸系膜淋巴結、脾臟和胸腺）中IL-2、IL-6和IL-10及其相應受體mRNA表達水平進行檢測。結果顯示：經(jīng)1h、2h和4h的運輸應激后，腸系膜淋巴結中三種細胞因子的表達在運輸前后和運輸

9、過程中均發(fā)生了顯著的變化，且均是4h時達到最大值，并顯著的高于對照組、1h組和2h組(P＜0.01)；受體mRNA也發(fā)生了顯著變化，但趨勢和細胞因子的表達不盡相同；脾臟中IL-10mRNA、IL-6mRNA、IL-6RmRNA及IL-10RmRNA的表達亦發(fā)生了顯著的變化；在胸腺中，除了IL-6RmRNA外，三種細胞因子mRNA及IL-2RmRNA,IL-10RmRNA在運輸前后和過程中均有顯著變化。因此，豬在運輸應激過程中，不同免疫器

10、官細胞因子及其受體的表達不盡相同，而血清中細胞因子含量的變化是三種免疫器官共同調控的結果。
　　 為找到運輸應激過程中導致豬免疫機能變化的主要調節(jié)物，使用SPASS分析軟件中的單尾分析法對淋巴細胞增殖效應及血清中細胞因子含量以及與各免疫器官中細胞因子及受體表達之間的關系進行皮爾森相關系數(shù)分析。結果顯示：豬血清中IL-6含量的變化與運輸豬血清1:32稀釋時T、B淋巴細胞轉化率的相關系數(shù)分別為0.823和0.764，血清中IL-10

11、含量的變化與運輸豬血清1:32稀釋時T淋巴細胞轉化率的相關系數(shù)為0.789，且統(tǒng)計學上均呈現(xiàn)極顯著的差異（P＜0.01）。在腸系膜淋巴結中，IL-6mRNA水平與血清中IL-10含量呈明顯負相關（r=-0.719,P=0.004），IL-2mRNA的表達也與血清中IL-10含量呈明顯負相關(r=-0.720，P=0.004)；在脾臟中，IL-6mRNA水平與血清IL-6含量又明顯正相關（r=0.669，P=0.009），且IL-6mRN

12、A的表達和血清中的IL-10也存在明顯的正相關(r=0.663，P=0.009)；在胸腺中，IL-10mRNA和IL-10RmRNA水平與血清中IL-10含量分別呈明顯正相關(r=0.712,P=0.000),IL-6mRNA的表達和IL-2mRNA也存在明顯的正相關(r=0.768,P=0.000)。統(tǒng)計學分析表明：IL-6可作為豬運輸后免疫功能變化的標志物，且胸腺和脾臟分別是調節(jié)IL-10和IL-6的重要免疫器官，而腸系膜淋巴結則對

13、IL-10起負反饋的調節(jié)作用。
　　 為探討豬運輸應激過程中免疫器官對各種細胞因子表達的調控，運用ELISA方法對運輸應激豬腸系膜淋巴結、脾臟和胸腺細胞中P38MAPK進行定量檢測，運用激光掃描共聚焦顯微鏡對NF-κB在三種免疫器官中進行表達和定位的檢測。結果顯示：胸腺中，P38MAPK的表達在運輸后2h顯著高于1h組、4h組和對照組（P＜0.05）：腸系膜淋巴結和脾臟運輸前后和過程中P38MAPK的表達均沒有發(fā)生顯著的變化。三

14、種免疫器官中的NF-κB，在運輸前后的胞漿和胞核中均有分布，但分布率不盡相同，陽性細胞數(shù)均隨著運輸時間的延長逐漸增加，4h時達到最大值；NF-κB的入核率也隨著運輸時間的延長而增高，運輸后4h達到最大值，與陽性細胞數(shù)的變化趨勢相同。上述結果表明，P38MAPK-NF-κB是豬運輸應激過程中調控免疫器官細胞因子表達的重要信號系統(tǒng)。
　　 以上試驗研究結果表明：運輸應激對豬免疫機能的影響存在時間效應，運輸1h、2h可使免疫機能代償性