花瓣對稱性基因的克隆及LjCYC2對露地菊的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、露地菊(Chrysanthemum morifolium)是園林綠化觀賞植物中常用的花卉之一。其花型多、顏色豐富,觀賞價值較高。本研究以‘松江白鶴’為實驗材料,克隆獲得一個花瓣對稱性基因。結(jié)構(gòu)分析及同源比對結(jié)果表明,該基因為CYC家族基因。以露地菊‘火焰’葉片為外植體,優(yōu)化了其再生體系,以LjCYC2為目的基因,建立了露地菊的遺傳轉(zhuǎn)化體系,并獲得轉(zhuǎn)基因株系。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用RT-PCR技術(shù)從‘松

2、江白鶴’花瓣中分離得到一個花瓣對稱性cDNA克隆。經(jīng)測序及結(jié)構(gòu)分析,該基因全長898bp,具有典型的TCP-domain和R-domain。同源比對結(jié)果顯示,該基因為CYC家族基因,并與多種花瓣對稱性基因具有親緣關(guān)系。
　　 2.露地菊葉片外植體再生體系的優(yōu)化
　　 露地菊‘火焰’葉片外植體的最適分化培養(yǎng)基為:MS+0.5 mg/L BA+1.5 mg/LNAA。但不同葉齡的外植體在該培養(yǎng)基上的分化率不同,上部葉片分化頻

3、率高達96％,中部葉片分化率為62％,而近根部葉片分化率最低,為37％,可能是不同發(fā)育狀態(tài)葉片其內(nèi)源激素存在差異的結(jié)果。梯度BA濃度對愈傷組織的誘導(dǎo)無明顯差異,但在一定范圍內(nèi),高濃度的BA會促進愈傷組織的不定芽分化率。當BA濃度超過0.5mg/L時,反而會抑制愈傷組織的分化。在本實驗中,BA濃度為0.Smg/L的分化培養(yǎng)基M1上生長30d時,外植體分化的不定芽最多,分化率為92％。
　　 露地菊轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。潮霉素對愈傷組織誘

4、導(dǎo)具有強烈的抑制作用,在濃度為10 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后,部分葉片外植體開始褐化;隨著潮霉素濃度梯度的升高,褐化程度逐漸加重:在30mg/L Hyg的培養(yǎng)基中表現(xiàn)為全部死亡。因此,選擇壓力確定為10mg/L。此外,本試驗中探討的既能有效的抑菌又能最大限度的保證葉片再生的脫菌濃度為300 mg/L的Cef。隨著殘留農(nóng)桿菌的減少,可以適時逐步降低培養(yǎng)基中Cef的使用濃度,以便陽性植株的發(fā)生。在本實驗中探討的最適預(yù)培養(yǎng)時間為2-4d