龍眼子葉胚發(fā)育相關的若干基因克隆及序列分析.pdf

1、龍眼(Dimocarpus Longan Lour)屬無患子科(Sapindaceae)龍眼屬，是我國南方諸省較重要而有特色的一種熱帶亞熱帶木本果樹。由于龍眼合子胚遺傳背景復雜，童期長，阻礙對其胚胎發(fā)育相關基因的研究。本文以龍眼子葉胚為材料，建立cDNA-AFLP技術體系，分析龍眼胚胎發(fā)育相關的基因差異表達，為研究龍眼胚胎發(fā)育奠定基礎。建立了RACE體系，克隆了看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)，并作為后續(xù)試驗的內(nèi)參；以這個

2、RACE體系克隆了一系列與龍眼胚胎發(fā)育相關的基因，同時對這些基因在胚胎發(fā)育中的表達特性也進行了研究。 1利用cDNA-AFLP技術分析龍眼子葉胚的發(fā)育 分別以小量法和大量法提取‘紅核子’龍眼謝花后35天子葉胚(早期子葉胚)和50天“紅核子”龍眼子葉胚(晚期子葉胚)的RNA，經(jīng)過合成雙鏈cDNA、酶切、加接頭、預擴增和選擇性擴增一系列步驟，建立適宜于龍眼子葉胚的cDNA-AFLP分析體系，得到了條帶清晰、對應良好、信號強度

3、基本一致、分布均勻的cDNA-AFLP指紋圖譜，對41個差異片段回收克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)其中21個與已知功能基因具有高度同源性，這些基因的功能主要涉及側(cè)生器官的離軸極性、糖酵解、能量代謝、離子轉(zhuǎn)運、細胞壁伸長、細胞周期調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)錄、RNA翻譯和調(diào)控、蛋白磷酸化調(diào)控和降解、信號轉(zhuǎn)導等；另外20個片段與已知基因的同源性較低或未發(fā)現(xiàn)同源性。隨機挑選7個進行RACE擴增，RT-PCR檢測其表達情況。 2龍眼子葉胚GAPDH基因全長c

4、DNA克隆及序列分析 根據(jù)Super SMARrTM PCR cDNA Synthesis Kit特點，設計兩端錨定引物，同時根據(jù)與已知的GAPDH基因高度同源的EST序列設計巢式引物，成功地擴增出該基因的3′端和5′端，說明這種RACE方法適合用于擴增龍眼子葉胚的基因。 序列分析表明，該基因的cDNA全長為1395bp，包括一個長1008bp，編碼336個氨基酸的開放閱讀框，其核苷酸和氨基酸序列與其他物種的GAPDH基

5、因具有高度同源性。GAPDH基因是組成型表達，可以作為內(nèi)參基因。 3龍眼子葉胚離軸極性基因YABBY2的克隆和序列分析 采用巢式的RACE方法，獲得與擬南芥YABBY2同源的基因，共獲得三個全長YAB2-1，YAB2-2，YAB2-3和三個片段YAB24，YAB2-5，YAB2-6。 生物信息學分析表明這幾個基因有不同的3′端非編碼區(qū)和5′端非編碼區(qū)，有高度一致的開放閱讀框，在YAB2-1，YAB2-2，YAB2

6、-3的5′端非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似的IRES序列。 半定量RT-PCR分析表明YAB2-3在早期子葉胚顯著地表達，在晚期子葉胚中微量表達；YAB2-1和YAB2-2在早期和晚期胚都顯著表達，但早期表達量大；YAB2-4是微量表達的基因，在晚期胚胎表達量較大。 4龍眼胚胎FVE、Remorin、CCR4-NOT等基因克隆和序列分析 采用巢式的RACE方法，成功地擴增龍眼的FVE、Remorin、CCR4-NOT的全長序列

7、，獲得硫轉(zhuǎn)運蛋白基因的5′端序列、脫水應答蛋白相關基因3′端序列和幾丁質(zhì)酶基因3′端序列。FVE基因具有WD40superfamily結(jié)構域，表達量極其顯著，早期表達量較大；Remorin基因在早期胚中顯著地表達，在晚期胚微弱地表達；CCR4-NOT基因在早期和晚期胚都顯著表達，早期胚胎表達量較大；硫轉(zhuǎn)運蛋白基因是微量表達的基因，在早期胚胎中表達量較大；幾丁質(zhì)酶基因也是微量表達的基因，在晚期胚胎表達量較大。脫水應答蛋白的相關基因在早期胚