紅麻花藥發(fā)育相關(guān)基因MYB21的克隆及功能研究.pdf

1、花是開花植物的繁殖器官，花藥則是雄蕊的重要功能部分，花藥的發(fā)育與植物的繁殖能力密切相關(guān)。花藥的發(fā)育是一個受到精準而復雜調(diào)控的過程，尤其是在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控更加重要，轉(zhuǎn)錄因子就是這一調(diào)控過程中的主要參與者，在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族之一，涉及到植物多種多樣的生理生化過程，其中許多MYB轉(zhuǎn)錄因子對植物花藥（包括花粉）的發(fā)育有著重要的調(diào)控作用。另外，花藥的發(fā)育異常往往是作物雄性不育的直觀表現(xiàn)，而作物細胞質(zhì)

2、雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的理論基礎(chǔ)和重要途徑。紅麻作為21世紀最具有發(fā)展?jié)摿Φ亩嘤猛咀魑镏?，研究紅麻花藥發(fā)育與轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系具有重要現(xiàn)實意義。本實驗通過對紅麻轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果進行分析，篩選出MYB21基因進行具體研究，初步研究結(jié)果如下:
　　1.利用改良的CTAB法提取出了高質(zhì)量的紅麻不育系P3A和保持系P3B花藥的總DNA和總RNA。采用同源克隆的方法，結(jié)合紅麻轉(zhuǎn)錄組高通量測序結(jié)果，搜索MYB21基因序列并在其最長O

3、RF起始端設(shè)計引物，以cDNA以及總DNA為模板，克隆出了MYB21基因的序列，并通過cDNA和總DNA水平分析得出，該基因DNA含有兩個內(nèi)含子，序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號為KT898146。
　　2.提取紅麻不育系和保持系的根、葉、花藥的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到濃度一致的cDNA，以紅麻甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，根據(jù)熒光定量引物設(shè)計原則，設(shè)計目的基因和內(nèi)參基因的特異性引物，采用熒光染料嵌合法進行定量分

4、析該基因在不育系和保持系各器官的表達量情況。結(jié)果表明MYB21基因在不育系花藥中的表達量顯著低于其在保持系花藥中的表達量，這一結(jié)果與紅麻高通量轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致，因此推測該基因參與了紅麻花藥的發(fā)育。
　　3.根據(jù)MYB21基因cDNA序列設(shè)計用于擴增過表達片段的引物，并在引物5'端加上相應的酶切位點序列和保護堿基，利用連接酶將過表達片段連接到PBI121-GFP載體上，酶切及測序證實過表達載體構(gòu)建成功。
　　4.根據(jù)RNA