基于偽型病毒的豬瘟中和抗體檢測方法的初步建立及豬瘟病毒E2蛋白的細胞定位研究.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine：fever virus，CSFV)引起豬群爆發(fā)的一種重要的烈性傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。預(yù)防CSFV感染的有效方法是采用疫苗免疫，建立穩(wěn)定而有效的中和抗體檢測方法是評價疫苗免疫效果的重要手段。
　　 豬瘟偽型病毒(VSV△G*CSF)，是指用表達綠色熒光蛋白(GFP)的報告基因代替水皰性口炎病毒(Vesicular stoma

2、titis virus，VSV)基因組中編碼囊膜蛋白G的基因，從而形成含有報告基因的復(fù)制缺陷型病毒(VSV△G*)；當(dāng)外源提供CSFV囊膜蛋白時，可與。VSV△G*重新裝配，整合成具有一過性感染力的VSV重組病毒VSV△G*CSF。該病毒擁有VSV的基因組，囊膜上整合有CSFV的囊膜蛋白，因此具有了CSFV的感染特征，這種基因型和表現(xiàn)型不一致的現(xiàn)象叫偽型，具有這種特征的病毒叫豬瘟偽型病毒。
　　 本研究通過構(gòu)建表達CSFV全部囊

3、膜蛋白的重組真核表達質(zhì)粒Pcagg-E012順式表達出CSFV囊膜蛋白Ems、E1和E2。結(jié)合已有對瘟病毒的報道，通過生物軟件進行比對與分析后，推測位于CSFV囊膜蛋白E2基因跨膜區(qū)內(nèi)的膜錨定序列是阻礙其表達在細胞表面的主要因素，對E2錨定序列進行部分缺失后發(fā)現(xiàn)：E2錨定序列的部分缺失舍減少E2蛋白在細胞內(nèi)的表達，說明錨定序列對E2的正確表達意義重大。只有表達全部CSFV囊膜蛋白，才能夠研制出滴度相對較高的豬瘟偽型病毒VSV△G*CSF

4、，其病毒的滴度為102～103pfu·Ml-1，且該病毒能夠被抗CSFV的陽性血清所中和。
　　 傳統(tǒng)檢測豬瘟病毒中和抗體的ELISA以及間接免疫熒光方法普遍存在費時、繁瑣、不夠精確、特異性差等一系列缺陷，亟待改進。為了提高CSFV中和抗體檢測的效率和生物安全性、研究CSFV的侵染機制，本研究制備出含有報告基因的復(fù)制缺陷型。VSV／CSFV偽型病毒(VSV△G*CSF)作為代替野生型CSFV的感染模型進行中和試驗，使檢測過程更加

5、安全、簡單，結(jié)果評定更加直觀、有效。經(jīng)研究表明，200pfq的VSV△G*CSFV可被150倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)豬瘟陽性血清所中和，利用該方法檢測10份現(xiàn)地待檢樣品，結(jié)果顯示7份為陽性，3份為陰性，與商品化試劑盒檢測結(jié)果的符合率為90％，表明該方法能夠作為一種新型的檢測工具，應(yīng)用于豬瘟中和抗體檢測。同時，本研究對傳統(tǒng)利用重組VSV系統(tǒng)制各偽型病毒的方法進行改良，節(jié)省了制備的時間，減少了表達蛋白對細胞的損傷，提高了工作效率。
　　 關(guān)于C

6、SFV致病機制的研究報道甚少，本研究用豬瘟偽型病毒。VSV△G*CSF感染敏感細胞PK-15不同的時間后，利用激光共聚焦顯微鏡觀測E2蛋白在被感染細胞中的存在情況。分別對感染后10、20、35和60min的PK-15細胞中E2的定位進行觀測，結(jié)果表明：在被CSFV感染的過程中，E2蛋白先吸附在被感染細胞的細胞表面，逐漸進入到細胞內(nèi)部，主要存在于細胞質(zhì)中，不會進入到細胞核內(nèi)，揭示了E2在CSFV的吸附與進入的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究為進

7、一步研究豬瘟病毒的致病機制莫定基礎(chǔ)。
　　 雖然豬瘟偽型病毒研制成本較高，難以實現(xiàn)規(guī)?；笈可a(chǎn)，同時VSV△G*CSF的病毒滴度較野生型CSFV低，但因為其生物安全性好，且攜帶有報告基因便于定性或定量檢測，故可以作為中和試驗中CSFV的替代品，成為新型檢測工具應(yīng)用于豬瘟中和抗體的測定，使CSFV的抗體檢測更加安全，直觀，快速。同時將豬瘟偽型病毒VSV△G*CSF作為引起主要保護性抗原E2基因的傳遞工具，用于研究被CSFV感染