三七消減文庫構(gòu)建和皂甙合成關(guān)鍵酶基因克隆及表達.pdf

1、三七(Panax notoginseng(Burk．)F．H．Chen)為五加科人參屬植物，是云南的道地藥材，有“南方人參”之稱。達瑪烷型四環(huán)三萜皂甙是三七的主要活性物質(zhì)，在血液系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、物質(zhì)代謝以及抗炎、抗衰老、抗腫瘤等方面均有較好的活性。三七皂甙含量與三七的生長年限和生長部位有關(guān)。根部是重要藥用器官，且3年生根的皂甙含量高于1年生根。推測三七皂甙含量的時間性差異很可能和皂甙生物合成相關(guān)基因差異表達調(diào)控有

2、關(guān)。為了解三七達瑪烷型皂甙合成的分子機理，必須首先克隆到相關(guān)的差異表達基因并進行深入的研究。 該研究利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建了三七1年生根和3年生根cDNA的正反向抑制減消文庫。結(jié)果表明：正向消減文庫包括2,000個cDNA克隆，反向消減文庫包括500個cDNA克隆，2個庫的重組率都在95％以上，cDNA片段的長度分布在200～900 bp左右，平均長度約500 bp左右。消減效率檢測結(jié)果表明：消減雜交將18S rRNAL對照基

3、因減弱了32,000倍。以上結(jié)果表明：所構(gòu)建的cDNA文庫能夠滿足下一步實驗的要求。 對所得到的正反向消減文庫進行斑點雜交，分別從文庫中挑選插入片段在500 bp左右的質(zhì)粒200個，與1年生和3年生DIG標記的SSH-探針分別進行雜交，篩選到110個來自只在三七3年生根中表達或表達量增加的基因，80個來自只在三七1年生根中表達或表達量增加的基因。為進一步確定差異表達基因，我們從斑點雜交的陽性克隆中挑選了6個差異基因進行半定量RT

4、—PCR驗證，結(jié)果表明：在3年生根中發(fā)動蛋白鳥苷三磷酸酶效應子，γ-谷氨酰水解酶，多銅氧化酶Ⅰ型家族蛋白，IspG蛋白，還原型輔酶I氧化酶家族蛋白基因表達上調(diào)，而S腺苷高半胱氨酸水解酶基因表達下調(diào)，提示抑制消減雜交篩選到的大多基因如果在3年生根中高表達，則在1年生根中不表達或差異表達。6個差異表達基因同源比對功能分析結(jié)果表明：IspG蛋白是皂甙生物合成途徑中關(guān)鍵酶，其它5個基因可能與皂甙的合成有直接或間接關(guān)系。 IspG蛋白生物信息學分

5、析結(jié)果表明.IspG蛋白的EST由524個核苷酸組成，編碼146個氨基酸殘基，分子量為15.636 KDa。有1個與轉(zhuǎn)錄子有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，功能位點有N-豆蔻?；稽c，N-糖基化位點，酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點。其同源性在植物中達90％以上，在微生物中達50％。亞細胞定位于細胞質(zhì)。 對91個EST克隆測序和序列組裝分析結(jié)果表明：有4個重疊群(Contig)和83個單拷貝EST(Singlet)，代表了共計87個獨立基因(Unigene)

6、，其中23個cDNA含有poly A序列，占整個克隆數(shù)的26.4％。功能分類結(jié)果表明：已知功能的唯一序列共58個，占66.6％，未知功能唯一序列29個，占33.3％。對已知功能基因分類，得到11類，其中大多基因與代謝途徑和分泌途徑有關(guān)。 對37個氨基酸序列可通讀的EST進行生物信息學分析，其中跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽分析結(jié)果表明：3個克隆有跨膜結(jié)構(gòu)，8個克隆有信號肽或是信號錨定蛋白。功能位點分析結(jié)果表明：大多數(shù)基因與胞外分泌，調(diào)節(jié)細胞凋

7、亡和細胞周期，信號傳導有關(guān)。功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明：除10個克隆沒有預測到功能結(jié)構(gòu)域外，其它結(jié)構(gòu)域與信號傳導，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，電子傳遞等有關(guān)。亞細胞定位大多數(shù)位于細胞質(zhì)中。 鯊烯環(huán)氧酶是皂甙生物合成途徑過程中的1個重要的限速酶。根據(jù)人參鯊烯環(huán)氧酶cDNA序列合成引物，我們從三七根中擴增到三七鯊烯環(huán)氧酶全長cDNA。該基因開放閱讀框含有1，622個核苷酸，編碼537個氨基酸殘基，其分子量為59.139 KDa，等電點為8.81(GenB

8、ank登錄號DQ386734)。同源性分析結(jié)果表明，三七鯊烯環(huán)氧酶與其它生物鯊烯環(huán)氧酶均具有不同程度的同源性。與人參鯊烯環(huán)氧酶同源性達到9896，進化樹的分析為同一祖先。生物信息學分析三七鯊烯環(huán)氧酶基因含有FAD功能區(qū)，以Rossmann折疊的NAD(P)-結(jié)合區(qū)，F(xiàn)AD/NAD(P)-結(jié)合區(qū)，疏水性，跨膜結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)和基序說明三七鯊烯環(huán)氧酶是一個膜蛋白，可從胞質(zhì)溶膠中分泌出來。三七鯊烯環(huán)氧酶中含有WD domain，G-beta r