miR-638通過(guò)SPAG1介導(dǎo)調(diào)控豬睪丸支持細(xì)胞生長(zhǎng)的研究.pdf

1、microRNA(miRNA)能與特定基因結(jié)合，直接降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻譯過(guò)程，在動(dòng)植物體內(nèi)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。大量的研究表明，在動(dòng)物睪丸組織中miRNA對(duì)睪丸的發(fā)育和成熟及精子發(fā)生過(guò)程發(fā)揮至關(guān)重要的作用。我們課題組前期經(jīng)過(guò)測(cè)序分析已經(jīng)證實(shí)miR-638在大白豬性成熟前后睪丸組織中差異表達(dá);miR-638能夠靶向精子相關(guān)抗原1（Sperm-associated antigen1，SPAG1）基因，并對(duì)公豬睪丸支持細(xì)胞的

2、凋亡有一定的影響。在這些基礎(chǔ)上，本課題以miR-638為主要研究對(duì)象，探究miR-638對(duì)豬睪丸ST細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以及在豬精子發(fā)生過(guò)程中的作用，并探究相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制。本課題主要研究結(jié)果如下:
　　1.miR-638和靶基因SPAG1對(duì)ST細(xì)胞功能的影響
　　通過(guò)合成miR-638mimic和inhibitor分別來(lái)超表達(dá)miR-638和抑制表達(dá)miR-638。通過(guò)構(gòu)建靶基因SPAG1的干擾片段SPAG1-siRNA來(lái)抑制表

3、達(dá)SPAG1基因。
　　通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-638對(duì)ST細(xì)胞周期的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超表達(dá)miR-638可以抑制ST細(xì)胞周期S期的比例，抑制ST細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化;抑制表達(dá)SPAG1基因同樣也可抑制ST細(xì)胞周期S期的比例，抑制G1期向S期的轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-638和靶基因SPAG1對(duì)ST細(xì)胞的作用效果相似，說(shuō)明miR-638通過(guò)靶基因SPAG1對(duì)ST細(xì)胞的細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。通過(guò)MTT法檢測(cè)了miR-638對(duì)

4、ST細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超表達(dá)miR-638可以顯著抑制ST細(xì)胞增殖，抑制表達(dá)miR-638可以顯著促進(jìn)ST細(xì)胞的增殖。
　　2.miR-638調(diào)控ST細(xì)胞生長(zhǎng)的分子機(jī)制研究
　　通過(guò)Q-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-638對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超表達(dá)miR-638能抑制ST細(xì)胞中c-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表達(dá)水平;同樣，抑制表達(dá)SPAG1抑制c-MYC、

5、CCNE1、CCND1和CDK4的表達(dá)水平。
　　通過(guò)Western blot檢測(cè)miR-638和靶基因SPA G1對(duì)PI3K/AKT通路的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:超表達(dá)miR-638能夠抑制ST細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白質(zhì)磷酸化水平，抑制表達(dá)miR-638能夠促進(jìn)PI3K和AKT蛋白質(zhì)磷酸化水平;同樣，抑制表達(dá)SPAG1可以抑制ST細(xì)胞中PI3K和AKT蛋白質(zhì)磷酸化水平。
　　3.SPAG1對(duì)細(xì)胞有絲分裂的影響
　　通過(guò)