miR-26介導EZH2調控肝癌細胞增殖及遷移的作用機制研究.pdf

1、研究背景: 原發(fā)性肝癌是各類癌癥細胞中惡性程度極高、且預后是最差的一類，俗稱“癌中之王”。亞洲東南部、非洲肝癌發(fā)生率一直保持較高的水平，歐洲和美國肝癌發(fā)病率也一直較高。國內目前原發(fā)性肝癌患者人數約為全球肝癌總人數的50％以上，年均約有11萬人死于該類疾病。在我國乙肝病毒和丙肝病毒感染是肝癌發(fā)生的主要病因。臨床治療肝癌存在確診多為中晚期、早期確診困難、預后極差以及高復發(fā)轉移率的主要問題。早期診斷和治療是治療肝癌的有效方法，但目前缺乏可靠的

2、臨床篩選方法。約三分之二的肝癌患者在得到診斷的時候已經處于肝癌晚期。肝癌對多數的化療藥物均會出現化療耐藥，即使接受過手術的患者多數會發(fā)生復發(fā)和轉移，五年生存率為30-40％。因此更好的明確肝癌發(fā)病機理有助于更好的探究治療方法有效性和早期診斷指標。
　　miR-26a位于人3號染色體，全長21個核苷酸，包括miR-26a-1，miR-26a-2和miR-26b。miR-26a-1，miR-26a-2 and miR-26b多種組織中

3、具有表達，表達也不存在特異性。研究發(fā)現鼻咽癌、肺癌、乳腺癌研究中均發(fā)現miR-26a的抑癌作用。miR-26a在上述腫瘤中的作用已經獲得一定的研究證實，過表達miR-26a可以通過調控下游靶基因進一步抑制上訴惡性腫瘤細胞的增殖?？紤]到miR-26a與腫瘤相關性非常高、關系密切，由此提出將miR-26a作為肝癌治療的切入點。通過查閱文獻發(fā)現，治療性的miR-26a傳遞采用腺相關病毒(AAV)載體可抑制癌細胞形成，誘導腫瘤細胞凋亡，阻斷疾病

4、進程，而沒有明顯副作用。IFN-α治療可以升高患者腫瘤內miR-26a表達，改善肝癌患者的總生存。而干擾素是目前治療肝細胞癌的免疫治療方案之一，相對副作用小，有效率并不亞于傳統(tǒng)藥物化療。這兩個證據提示IFN-α可能通過提升腫瘤內 miR-26a表達來起到抑制腫瘤生長的作用。EZH2作為miR-26a潛在靶基因，而EZH2可甲基化組蛋白H3賴氨酸27(H3K27)及調控轉錄基因沉默。前期研究表明沉默腫瘤細胞中EZH2基因表達可以抑制nud

5、e小鼠模型中腫瘤發(fā)生，體現出抑制EZH2在肝癌中的潛在治療作用。近年來研究顯示肝癌組織中EZH2高表達與與肝癌侵襲性或預后不良有關。但是肝癌對IFN-α治療敏感性的機制研究目前還不清楚，需要進一步闡明IFN-α治療產生的肝癌細胞內的鏈式反應。
　　目的: 探討miR-26a在原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉移中的作用機制;明確肝癌細胞中miR-26a及EZH2與正常肝臟細胞表達差異情況;明確miR-26a在原發(fā)性肝癌生物學行為中的直接作用

6、目的靶基因;通過調控miR-26a的表達水平分析其對肝癌細胞增殖和遷移的影響，并探討干擾素-α在原發(fā)性肝癌治療中的作用機理，為闡明原發(fā)性肝癌的發(fā)病機制和新的分子靶向治療提供可參考數據和理論思路。
　　方法: 首先檢測并分析正常小鼠肝細胞株和肝癌細胞株（人，小鼠）、臨床肝癌組織及癌旁組織中miR-26a和EZH2的表達情況。其次采用熒光素酶檢測，構建pGL3-EZH2-3'UTR野生型質粒和突變型質粒，轉染miR-26a及抑制物，通

7、過雙熒光素酶測定活性，以明確EZH2是否為miR-26a的直接作用目的靶基因。最后利用qRT-PCR，Western blot及Northern blot技術，檢測干擾素-α對肝癌細胞中miR-26a及EZH2表達的影響，并觀察該影響是否有劑量依賴性;并利用miR-26a模擬物及miR對照物轉染HepG-2肝癌細胞，進一步檢測過表達miR-26a對EZH2表達的影響，以及過表達miR-26a在體外實驗中對肝癌細胞增殖和遷徙的抑制作用。<

8、br>　　結果:
　　1.與正常肝細胞株比較，4種肝癌細胞株中miR-26a表達顯著下調;同樣， miR-26a在原發(fā)性肝癌組織中的表達也明顯低于癌旁組織。而EZH2在人肝癌細胞SMMC-7721和HepG-2中的表達與正常肝細胞比較，具有顯著上調特點;同樣，EZH2在癌旁組織中的表達量顯著低于原發(fā)性肝癌組織。miR-26a和EZH2在肝癌細胞和原發(fā)性肝癌組織中的表達呈負相關，提示兩者間存在負調控關系。
　　2.采用Targ

9、etScan生物學軟件分析miR-26a與EZH2間關系，發(fā)現miR-26與EZH2的3'UTR之間存在7個堿基呈現完全的互補配對，同時發(fā)現EZH2-3'UTR中存在4個堿基突變位點。通過轉染miR-26a可以顯著抑制了野生型EZH2-3'UTR報告基因質粒的熒光素酶活性，但對于EZH2-3'UTR突變序列報告基因質粒的熒光素酶活性改變不具顯著性差異;而轉染miR-26a抑制劑可以明顯增加野生型EZH2-3'UTR報告基因質粒的熒光素酶

10、活性，面對EZH2-3'UTR突變序列報告基因質粒的熒光素酶活性改變無統(tǒng)計學差異。小鼠正常肝細胞BNL CL.2和小鼠肝癌細胞Hepa1-6中過表達miR-26a后，可以明顯抑制EZH2的mRNA水平，而抑制miR-26a表達則可以顯著增加EZH2的mRNA水平。上述結果提示，miR-26a可直接作用于EZH2，轉錄后可抑制EZH2表達。3.mir-26a通過阻斷EZH2促進干擾素-α抑制肝癌增殖和遷移
　　3.1肝癌細胞中IFN

11、-α促進miR-26a表達降低EZH2表達肝癌細胞HepG2給予IFN-α治療0h、12h、24h和48h后，采用qRT-PCR方法測定miR-26a和U6表達。治療12h后miR-26a相對于U6表達水平顯著升高，治療24h后升至最高，一直維持到48h。應用Northem印跡雜交測定miR-26a表達，可見miR-26a相對于U6表達水平百分比與以上結果相同，24h和48h的miR-26a表達百分比與0h處理后相比差異具有統(tǒng)計學意義。

12、同樣評價IFN-α干預后EZH2的mRNA轉錄水平，IFN-α治療24h和48h后EZH2的mRNA表達水平顯著降低。與102 IU的IFN-α相比，103 IU的IFN-α更能抑制EZH2mRNA表達水平。其次測定肝癌細胞中EZH2蛋白表達，IFN-α抑制EZH2蛋白表達呈現劑量依賴性，特別是103 IU的IFN-α，EZH2表達比陰性對照比較降低近34％。
　　3.2肝癌細胞HepG-2中上調miR-26a阻斷EZH2表達為了

13、探討miR-26a和EZH2相關性，HepG2細胞分別轉染同等劑量的miR-26a模擬物或miR對照。無論20mM還是40mM，miR-26a模擬物組中相對miR-26a水平顯著高于miR對照組，可見肝癌細胞中miR-26a模擬物劑量和相對miR-26a水平存在劑量影響關系。其次，檢查肝癌細胞轉染24h后EZH2相對于β-actin的mRNA水平，可見miR-26a模擬物組和miR對照組間存在顯著性差異，轉染72h后EZH2的mRNA表

14、達穩(wěn)定。最后，應用蛋白印跡分析轉染后不同時間點的EZH2表達水平，三個時間點對照組和miR-26a組間存在顯著差異。結果表明上調miR-26a可抑制EZH2轉染水平的表達。
　　3.3 miR-26a誘導細胞生長抑制，降低HepG-2細胞遷移和侵襲
　　為了探討miR-26a對細胞增殖的影響，HepG-2細胞分別短暫轉染miR-26a模擬物和miR對照。MTT結果表明miR-26a模擬物抑制HepG-2細胞增殖，轉染后48h

15、抑制率為33％，72h抑制率為50％，P＜0.05。觀察HepG2細胞上miR-26a模擬物轉染對細胞生長的抑制作用，平板克隆形成試驗表明，與對照組相比，miR-26a模擬物組少見小群體。
　　分析miR-26a對肝癌細胞侵襲和遷移的影響，HepG2細胞遷移和侵襲用于分析。結果表明轉染48h后，上調miR-26a表達顯著抑制HepG2細胞遷移和侵襲。miR-26a模擬物組遷移細胞數量與對照組比較降低36％。與對照組比較，miR-2

16、6a組侵襲細胞數量分別下降37.5％和62.5％。HepG-2細胞分別轉染25nM和50nM模擬物。結果表明miR-26a在HepG-2細胞轉移中扮演抑制作用。
　　結論:
　　1.在體外肝癌細胞及臨床肝癌組織標本中miR-26a表達明顯降低，而EZH2表達顯著增高;
　　2.在肝細胞癌中EZH2是miR-26a作用的靶基因，兩者間存在負性調節(jié);
　　3.IFN-α體外誘導肝癌細胞miR-26a上調進而抑制EZH