miR-26介導(dǎo)EZH2調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及遷移的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 原發(fā)性肝癌是各類癌癥細(xì)胞中惡性程度極高、且預(yù)后是最差的一類，俗稱“癌中之王”。亞洲東南部、非洲肝癌發(fā)生率一直保持較高的水平，歐洲和美國肝癌發(fā)病率也一直較高。國內(nèi)目前原發(fā)性肝癌患者人數(shù)約為全球肝癌總?cè)藬?shù)的50％以上，年均約有11萬人死于該類疾病。在我國乙肝病毒和丙肝病毒感染是肝癌發(fā)生的主要病因。臨床治療肝癌存在確診多為中晚期、早期確診困難、預(yù)后極差以及高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率的主要問題。早期診斷和治療是治療肝癌的有效方法，但目前缺乏可靠的

2、臨床篩選方法。約三分之二的肝癌患者在得到診斷的時(shí)候已經(jīng)處于肝癌晚期。肝癌對(duì)多數(shù)的化療藥物均會(huì)出現(xiàn)化療耐藥，即使接受過手術(shù)的患者多數(shù)會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，五年生存率為30-40％。因此更好的明確肝癌發(fā)病機(jī)理有助于更好的探究治療方法有效性和早期診斷指標(biāo)。
　　miR-26a位于人3號(hào)染色體，全長21個(gè)核苷酸，包括miR-26a-1，miR-26a-2和miR-26b。miR-26a-1，miR-26a-2 and miR-26b多種組織中

3、具有表達(dá)，表達(dá)也不存在特異性。研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌、肺癌、乳腺癌研究中均發(fā)現(xiàn)miR-26a的抑癌作用。miR-26a在上述腫瘤中的作用已經(jīng)獲得一定的研究證實(shí)，過表達(dá)miR-26a可以通過調(diào)控下游靶基因進(jìn)一步抑制上訴惡性腫瘤細(xì)胞的增殖?？紤]到miR-26a與腫瘤相關(guān)性非常高、關(guān)系密切，由此提出將miR-26a作為肝癌治療的切入點(diǎn)。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，治療性的miR-26a傳遞采用腺相關(guān)病毒(AAV)載體可抑制癌細(xì)胞形成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，阻斷疾病

4、進(jìn)程，而沒有明顯副作用。IFN-α治療可以升高患者腫瘤內(nèi)miR-26a表達(dá)，改善肝癌患者的總生存。而干擾素是目前治療肝細(xì)胞癌的免疫治療方案之一，相對(duì)副作用小，有效率并不亞于傳統(tǒng)藥物化療。這兩個(gè)證據(jù)提示IFN-α可能通過提升腫瘤內(nèi) miR-26a表達(dá)來起到抑制腫瘤生長的作用。EZH2作為miR-26a潛在靶基因，而EZH2可甲基化組蛋白H3賴氨酸27(H3K27)及調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因沉默。前期研究表明沉默腫瘤細(xì)胞中EZH2基因表達(dá)可以抑制nud

5、e小鼠模型中腫瘤發(fā)生，體現(xiàn)出抑制EZH2在肝癌中的潛在治療作用。近年來研究顯示肝癌組織中EZH2高表達(dá)與與肝癌侵襲性或預(yù)后不良有關(guān)。但是肝癌對(duì)IFN-α治療敏感性的機(jī)制研究目前還不清楚，需要進(jìn)一步闡明IFN-α治療產(chǎn)生的肝癌細(xì)胞內(nèi)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
　　目的: 探討miR-26a在原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制;明確肝癌細(xì)胞中miR-26a及EZH2與正常肝臟細(xì)胞表達(dá)差異情況;明確miR-26a在原發(fā)性肝癌生物學(xué)行為中的直接作用

6、目的靶基因;通過調(diào)控miR-26a的表達(dá)水平分析其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討干擾素-α在原發(fā)性肝癌治療中的作用機(jī)理，為闡明原發(fā)性肝癌的發(fā)病機(jī)制和新的分子靶向治療提供可參考數(shù)據(jù)和理論思路。
　　方法: 首先檢測(cè)并分析正常小鼠肝細(xì)胞株和肝癌細(xì)胞株（人，小鼠）、臨床肝癌組織及癌旁組織中miR-26a和EZH2的表達(dá)情況。其次采用熒光素酶檢測(cè)，構(gòu)建pGL3-EZH2-3'UTR野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染miR-26a及抑制物，通

7、過雙熒光素酶測(cè)定活性，以明確EZH2是否為miR-26a的直接作用目的靶基因。最后利用qRT-PCR，Western blot及Northern blot技術(shù)，檢測(cè)干擾素-α對(duì)肝癌細(xì)胞中miR-26a及EZH2表達(dá)的影響，并觀察該影響是否有劑量依賴性;并利用miR-26a模擬物及miR對(duì)照物轉(zhuǎn)染HepG-2肝癌細(xì)胞，進(jìn)一步檢測(cè)過表達(dá)miR-26a對(duì)EZH2表達(dá)的影響，以及過表達(dá)miR-26a在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和遷徙的抑制作用。<

8、br>　　結(jié)果:
　　1.與正常肝細(xì)胞株比較，4種肝癌細(xì)胞株中miR-26a表達(dá)顯著下調(diào);同樣， miR-26a在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)也明顯低于癌旁組織。而EZH2在人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG-2中的表達(dá)與正常肝細(xì)胞比較，具有顯著上調(diào)特點(diǎn);同樣，EZH2在癌旁組織中的表達(dá)量顯著低于原發(fā)性肝癌組織。miR-26a和EZH2在肝癌細(xì)胞和原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者間存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。
　　2.采用Targ

9、etScan生物學(xué)軟件分析miR-26a與EZH2間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-26與EZH2的3'UTR之間存在7個(gè)堿基呈現(xiàn)完全的互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)EZH2-3'UTR中存在4個(gè)堿基突變位點(diǎn)。通過轉(zhuǎn)染miR-26a可以顯著抑制了野生型EZH2-3'UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對(duì)于EZH2-3'UTR突變序列報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性改變不具顯著性差異;而轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑可以明顯增加野生型EZH2-3'UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶

10、活性，面對(duì)EZH2-3'UTR突變序列報(bào)告基因質(zhì)粒的熒光素酶活性改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小鼠正常肝細(xì)胞BNL CL.2和小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6中過表達(dá)miR-26a后，可以明顯抑制EZH2的mRNA水平，而抑制miR-26a表達(dá)則可以顯著增加EZH2的mRNA水平。上述結(jié)果提示，miR-26a可直接作用于EZH2，轉(zhuǎn)錄后可抑制EZH2表達(dá)。3.mir-26a通過阻斷EZH2促進(jìn)干擾素-α抑制肝癌增殖和遷移
　　3.1肝癌細(xì)胞中IFN

11、-α促進(jìn)miR-26a表達(dá)降低EZH2表達(dá)肝癌細(xì)胞HepG2給予IFN-α治療0h、12h、24h和48h后，采用qRT-PCR方法測(cè)定miR-26a和U6表達(dá)。治療12h后miR-26a相對(duì)于U6表達(dá)水平顯著升高，治療24h后升至最高，一直維持到48h。應(yīng)用Northem印跡雜交測(cè)定miR-26a表達(dá)，可見miR-26a相對(duì)于U6表達(dá)水平百分比與以上結(jié)果相同，24h和48h的miR-26a表達(dá)百分比與0h處理后相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12、同樣評(píng)價(jià)IFN-α干預(yù)后EZH2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，IFN-α治療24h和48h后EZH2的mRNA表達(dá)水平顯著降低。與102 IU的IFN-α相比，103 IU的IFN-α更能抑制EZH2mRNA表達(dá)水平。其次測(cè)定肝癌細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)，IFN-α抑制EZH2蛋白表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性，特別是103 IU的IFN-α，EZH2表達(dá)比陰性對(duì)照比較降低近34％。
　　3.2肝癌細(xì)胞HepG-2中上調(diào)miR-26a阻斷EZH2表達(dá)為了

13、探討miR-26a和EZH2相關(guān)性，HepG2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染同等劑量的miR-26a模擬物或miR對(duì)照。無論20mM還是40mM，miR-26a模擬物組中相對(duì)miR-26a水平顯著高于miR對(duì)照組，可見肝癌細(xì)胞中miR-26a模擬物劑量和相對(duì)miR-26a水平存在劑量影響關(guān)系。其次，檢查肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后EZH2相對(duì)于β-actin的mRNA水平，可見miR-26a模擬物組和miR對(duì)照組間存在顯著性差異，轉(zhuǎn)染72h后EZH2的mRNA表

14、達(dá)穩(wěn)定。最后，應(yīng)用蛋白印跡分析轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的EZH2表達(dá)水平，三個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和miR-26a組間存在顯著差異。結(jié)果表明上調(diào)miR-26a可抑制EZH2轉(zhuǎn)染水平的表達(dá)。
　　3.3 miR-26a誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制，降低HepG-2細(xì)胞遷移和侵襲
　　為了探討miR-26a對(duì)細(xì)胞增殖的影響，HepG-2細(xì)胞分別短暫轉(zhuǎn)染miR-26a模擬物和miR對(duì)照。MTT結(jié)果表明miR-26a模擬物抑制HepG-2細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染后48h

15、抑制率為33％，72h抑制率為50％，P＜0.05。觀察HepG2細(xì)胞上miR-26a模擬物轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用，平板克隆形成試驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，miR-26a模擬物組少見小群體。
　　分析miR-26a對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，HepG2細(xì)胞遷移和侵襲用于分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染48h后，上調(diào)miR-26a表達(dá)顯著抑制HepG2細(xì)胞遷移和侵襲。miR-26a模擬物組遷移細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組比較降低36％。與對(duì)照組比較，miR-2

16、6a組侵襲細(xì)胞數(shù)量分別下降37.5％和62.5％。HepG-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染25nM和50nM模擬物。結(jié)果表明miR-26a在HepG-2細(xì)胞轉(zhuǎn)移中扮演抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.在體外肝癌細(xì)胞及臨床肝癌組織標(biāo)本中miR-26a表達(dá)明顯降低，而EZH2表達(dá)顯著增高;
　　2.在肝細(xì)胞癌中EZH2是miR-26a作用的靶基因，兩者間存在負(fù)性調(diào)節(jié);
　　3.IFN-α體外誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞miR-26a上調(diào)進(jìn)而抑制EZH