蠶豆萎蔫病毒胞間運(yùn)動(dòng)管狀結(jié)構(gòu)及植物原生質(zhì)體骨架標(biāo)記技術(shù)研究.pdf

1、蠶豆萎蔫病毒2號(hào)(Broad bean wilt virus2，BBWV2)在我國(guó)廣泛發(fā)生，對(duì)許多經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害。為了弄清BBWV2在寄主植物體內(nèi)的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，本論文應(yīng)用電子顯微鏡對(duì)BBWV2的細(xì)胞病理結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，并應(yīng)用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)對(duì)病毒運(yùn)動(dòng)蛋白VP37進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。為了進(jìn)一步研究植物細(xì)胞骨架與病毒胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)年P(guān)系，分別以煙草BY-2懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和蠶豆葉肉細(xì)胞為材料，制備了兩種細(xì)胞的原生質(zhì)體，初步建立了原生質(zhì)體細(xì)胞

2、微管和微絲骨架的標(biāo)記方法，并研究了抑制劑Oryzalin和Latrunculin B處理對(duì)細(xì)胞骨架的影響。以上工作取得的主要結(jié)果如下：
　　 將BBWV2的分離物PVl31接種昆諾藜(Chenopodium quinoa)，透射電鏡下觀察感病細(xì)胞的超薄切片，發(fā)現(xiàn)PV131主要引起三種典型細(xì)胞病變：膜結(jié)構(gòu)增生、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)病毒結(jié)晶體、細(xì)胞質(zhì)中的管狀結(jié)構(gòu)聚集體。此外在胞間連絲處發(fā)現(xiàn)了穿越細(xì)胞壁的小管結(jié)構(gòu)，病毒粒子排列其中，證明了BBWV

3、2的胞間運(yùn)動(dòng)機(jī)制與同科的豇豆花葉病毒和葡萄扇葉病毒類似，完整病毒粒子通過胞間連絲處小管進(jìn)行運(yùn)輸。而細(xì)胞質(zhì)中的管狀結(jié)構(gòu)由病毒粒子組成，僅是病毒的一種聚集方式，與病毒的胞間運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)。利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)研究了VP37蛋白在感病細(xì)胞內(nèi)的定位，膠體金顆粒主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞壁胞間連絲處小管結(jié)構(gòu)上，說明VP37蛋白是小管結(jié)構(gòu)的主要成分。
　　 用酶解法分別制備了煙草BY-2懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和蠶豆葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體，所得原生質(zhì)體形態(tài)完整，

4、活力高。用TRITC-鬼筆環(huán)肽對(duì)微絲骨架進(jìn)行熒光染色，激光共聚焦顯微鏡顯示了原生質(zhì)體中微絲精細(xì)排列的均勻網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。用10μmol/L和20μmol/L的Latrunculin B處理原生質(zhì)體，共聚焦成像顯示了微絲解聚和微絲骨架分布的動(dòng)態(tài)過程。用小鼠β微管蛋白單克隆抗體間接免疫熒光標(biāo)記原生質(zhì)體中的微管骨架，共聚焦成像顯示了清晰的均勻網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，用10μmol/L的微管解聚劑Oryzalin處理原生質(zhì)體l小時(shí)后，微管骨架被完全破壞，只能看到點(diǎn)