抗鐮刀菌根腐病苜蓿品種的鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、紫花苜蓿鐮刀菌根腐病是一種慢性的潛在的世界性病害，在大多數(shù)產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。紫花苜蓿感染根腐病初期維管束變成褐色或紅褐色，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)主根內(nèi)部腐爛，分枝減少，側(cè)根大量死亡，固氮能力降低，壽命和利用年限縮短，草產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降。已報(bào)道紫花苜蓿鐮刀菌根腐病的病原主要為腐皮鐮刀菌(F.Solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)等菌種，鐮刀菌屬的其他致病性菌種報(bào)道較少。為查明是否有我國或世界上未發(fā)現(xiàn)

2、的可引起紫花苜蓿根腐病的鐮刀菌菌種以及探討紫花苜蓿響應(yīng)鐮刀菌侵染的機(jī)制，本研究于2012-2013年對河北廊坊、內(nèi)蒙古臨河和山西陽高縣的大面積栽培紫花苜蓿進(jìn)行田間調(diào)查，采集疑似感染鐮刀菌根腐病的紫花苜蓿病株，在PSA和MGA等培養(yǎng)基上分離純化，觀察菌落形態(tài)、顏色及分生孢子的大小、形態(tài)等指標(biāo)，并克隆其ITS和TEF-1α序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。通過在NCBI和Fusarium-ID鐮刀菌屬數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察確定菌種名稱，然后通

3、過回接試驗(yàn)確定其致病性。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，利用致病性較強(qiáng)的菌株對14個(gè)紫花苜蓿品種進(jìn)行抗病性評價(jià)，并通過透射電鏡觀察接種后紫花苜蓿根部的細(xì)胞形態(tài)和侵染機(jī)制。將抗病性最強(qiáng)和最弱的兩個(gè)材料用于紫花苜蓿響應(yīng)鐮刀菌侵染的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探討紫花苜蓿接種鐮刀菌后的應(yīng)答機(jī)制。其主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　共分離6個(gè)菌株，分別命名為C1、C2、C3、C4、C5和L1。根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定:C1和C2為三線鐮刀菌(F.tricinctum);

4、C3、C4和C5為腐皮鐮刀菌(F.solani); L1為層出鐮刀菌(F.proliferatum)。L1和C4菌株的致病性較強(qiáng)，發(fā)病率(DI)均大于80％，病害嚴(yán)重指數(shù)(DSI)分別為61.35％和59.26％。C2株系致病性最弱(DI54.44％，DSI29.63％)。C1、C3和C5菌株的發(fā)病率和致病性均無顯著差異，發(fā)病率分別為66.66％、62.22％和65.55％;病害嚴(yán)重指數(shù)分別為42.59％、40.37％和38.89％。其

5、中三線鐮刀菌和層出鐮刀菌是首次發(fā)現(xiàn)可引起我國紫花苜蓿根腐病的病原菌。
　　通過水培法和土培法接種L1菌株后，14個(gè)紫花苜蓿品種均感病，沒有免疫品種。水培接種法病情發(fā)展較快，接種5-7天感病植株開始表現(xiàn)病害癥狀。接種14天后調(diào)查顯示，感病植株根部壞死嚴(yán)重，地上部黃化。病害嚴(yán)重指數(shù)為41.5％～63.7％。其中AmeriGraze401+Z(41.5％)和WL903(43.0％)的抗病性較強(qiáng)，其次是Beaver(44.4％)、中苜2號

6、(47.4％)、Affinity(50.4％)和Alfking(50.4％)。肇東(56.7％)和WL656HQ(637％)的抗病性最弱。土培接種前期，根腐病發(fā)展較緩慢，接種80天后進(jìn)行病害調(diào)查，感病植株根莖壞死或有病斑。病害嚴(yán)重指數(shù)在38.9％～60.0％之間，其中AmeriGraze401+Z和Affinity的抗病性較強(qiáng)，病害嚴(yán)重指數(shù)分別為38.9％和40.4％。其次是WL903(42.8％)、Alfking(43.7％)和Bea

7、ver(43.9％)。WL656HQ(60.0％)和肇東(61.8％)抗病性最弱。綜合兩種接種方法的結(jié)果，抗病性最強(qiáng)的是AmeriGraze401+Z，最易感病的是WL656HQ。
　　以抗病品種(AmeriGraze401+Z)和感病品種(WL656HQ)為材料，接種鐮刀菌后，采用雙向電泳技術(shù)對根部組織和葉部組織進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，成功鑒定了93個(gè)差異蛋白點(diǎn)。其中66個(gè)來自根部組織，27個(gè)來自葉部組織。這些蛋白包括S-腺苷甲硫氨