大豆中疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的克隆與功能研究.pdf

1、由大豆疫霉（Phytophthorasojae）引起的大豆根、莖、苗和種子的腐爛病，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前生產(chǎn)上主要采用種植抗病品種來控制該病害，但傳統(tǒng)育種存在抗病材料的匱乏、育種周期長以及病原菌的快速變異導(dǎo)致的抗病基因時(shí)效變短等問題，因此抗病轉(zhuǎn)基因育種將是一種有效的手段，而在轉(zhuǎn)基因過程中，過量表達(dá)目的基因會(huì)引起植物的正常生長與發(fā)育，所以利用病原誘導(dǎo)性啟動(dòng)子是抗病轉(zhuǎn)基因育種的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究利用四個(gè)不同大豆

2、品種在大豆疫霉侵染過程中全基因表達(dá)譜的芯片數(shù)據(jù)，篩選了疫霉誘導(dǎo)早期快速上調(diào)表達(dá)的基因，并對(duì)其中的三個(gè)基因的啟動(dòng)子進(jìn)行了功能分析，并鑒定了它們的關(guān)鍵調(diào)控元件。主要包括以下研究?jī)?nèi)容:
　　大豆中疲霉誘導(dǎo)性基因的篩選:植物在病原菌侵染時(shí)，會(huì)調(diào)控許多基因的表達(dá)來參與防衛(wèi)反應(yīng)。根據(jù)已報(bào)道的大豆受疫霉侵染的全基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，通過T測(cè)驗(yàn)和SAM測(cè)驗(yàn)方法，篩選大豆中疫霉誘導(dǎo)表達(dá)基因，初步獲得198個(gè)基因EST，并分析對(duì)應(yīng)到大豆基因組中180個(gè)

3、差異表達(dá)基因。進(jìn)一步尋找這180個(gè)基因中上調(diào)表達(dá)更顯著的42個(gè)基因，通過qRT-PCR的方法驗(yàn)證這42個(gè)基因，鑒定到了8個(gè)在大豆疫霉侵染的初期快速上調(diào)表達(dá)的基因，為進(jìn)一步研究疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子提供了實(shí)驗(yàn)材料。
　　疫霉誘導(dǎo)性基因GmaPPO12啟動(dòng)子的研究:根據(jù)疫霉誘導(dǎo)性基因篩選的結(jié)果，克隆了一個(gè)大豆多酚氧化酶（GmaPPO12）基因，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)に卣T導(dǎo)不敏感。對(duì)啟動(dòng)子區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1500bp）的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子

4、包含很多已報(bào)道的病原誘導(dǎo)性順式元件。該啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因，在煙草瞬時(shí)表達(dá)和大豆根毛穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，均能在大豆疫霉的誘導(dǎo)下快速驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的上調(diào)表達(dá)，且其受誘導(dǎo)強(qiáng)度強(qiáng)于已知的PR1a基因。啟動(dòng)子的缺失分析最終鑒定到了一個(gè)113bp的疫霉誘導(dǎo)片段。全長啟動(dòng)子及該片段均能驅(qū)動(dòng)INF1在侵染點(diǎn)引起特異性細(xì)胞死亡。
　　疫霉誘導(dǎo)性基因GmaKSTI20啟動(dòng)子的功能分析及人工啟動(dòng)子的構(gòu)建:依據(jù)疫霉誘導(dǎo)性基因篩選的結(jié)果，我們克隆了大豆中一

5、個(gè)胰蛋白酶抑制子基因(GmaKSTI20)，該基因啟動(dòng)子區(qū)包含很多已報(bào)道的病原誘導(dǎo)性順式元件。將該啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因后，能在煙草瞬時(shí)表達(dá)和大豆根毛穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中介導(dǎo)疫霉誘導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)，且其受誘導(dǎo)強(qiáng)度強(qiáng)于已報(bào)道的PR1a基因。啟動(dòng)子的缺失分析最終鑒定到了一個(gè)受疫霉誘導(dǎo)的122bp的高活性片段。將該片段與前一章鑒定到的113bp活性片段進(jìn)行人工組合，發(fā)現(xiàn)雖然活性依然很高但是相對(duì)與單體沒有大幅的提高。進(jìn)一步人工合成該片段的四個(gè)重復(fù)單

6、元4XD，發(fā)現(xiàn)能高效的驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的誘導(dǎo)表達(dá)，并且能驅(qū)動(dòng)INF1在侵染位點(diǎn)特異性細(xì)胞死亡。
　　疫霉誘導(dǎo)性基因GmaDRRP啟動(dòng)子的功能初探:依照疫霉誘導(dǎo)性基因篩選的結(jié)果，我們克隆了大豆中一個(gè)受疫霉誘導(dǎo)表達(dá)的GmaDRRP基因啟動(dòng)子區(qū)（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的1500bp），發(fā)現(xiàn)該區(qū)域也包含很多逆境反應(yīng)相關(guān)順式元件。進(jìn)一步通過煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和大豆根毛穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系研究該啟動(dòng)子的功能。結(jié)果表明，GmaDRRP基因啟動(dòng)子能在不同的轉(zhuǎn)化體系中在疫

7、霉的誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。根據(jù)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)順式元件的位置，做缺失突變，沒有找到活性相對(duì)較高的區(qū)域或片段。以上結(jié)果表明，大豆的抗病反應(yīng)蛋白基因GmaDRRP啟動(dòng)子為疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子。
　　通過上述研究，我們?cè)诖蠖怪蝎@得了7個(gè)疫霉早期誘導(dǎo)性基因;對(duì)其中3個(gè)基因啟動(dòng)子進(jìn)行了功能分析，并驗(yàn)證其為疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子;進(jìn)一步對(duì)3個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行缺失突變分析，獲得了2個(gè)疫霉誘導(dǎo)性小片段，分別人工組合或合成疫霉誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，獲得了一個(gè)高效的疫霉誘導(dǎo)