采后蘋(píng)果與炭疽菌的相互作用及病害控制機(jī)理研究.pdf

1、果實(shí)采后腐爛是一個(gè)全球性問(wèn)題，已引起世界范圍的極大關(guān)注。蘋(píng)果炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）是蘋(píng)果上的主要病害，引致蘋(píng)果采后腐爛嚴(yán)重。本文從從保護(hù)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，以蘋(píng)果采后炭疽病為研究對(duì)象，利用物理的、化學(xué)的、生物的和農(nóng)業(yè)的無(wú)污染防除技術(shù)及分子鑒定診斷技術(shù)，逐步組建蘋(píng)果采后炭疽病可持續(xù)控制的病害防御體系。分別開(kāi)展了蘋(píng)果炭疽菌生物學(xué)特性研究，利用離子束生物工程和磁生物工程技術(shù)誘變的

2、枯草芽孢桿菌和蘋(píng)果炭疽菌低毒性菌株防治蘋(píng)果采后炭疽病的控病效果和作用機(jī)制研究，與環(huán)境相容好、高效、低毒、使用安全、對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)蘋(píng)果無(wú)污染，不影響外觀和風(fēng)味的新農(nóng)藥、新劑型和使用技術(shù)研究，品種抗病性鑒定及不同蘋(píng)果品種對(duì)炭疽病菌的抗性生理生化機(jī)制和蘋(píng)果炭疽菌致病機(jī)制研究，蘋(píng)果炭疽菌的快速分子鑒定和檢測(cè)及蘋(píng)果炭疽病的早期診斷。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1．蘋(píng)果炭疽菌生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，蘋(píng)果采后炭疽菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的溫度范圍為1

3、0℃～35℃，最適溫為28℃。菌絲致死溫度為40℃5d，分生孢子在40℃下培養(yǎng)11天后，仍具有萌發(fā)能力。分生孢子萌發(fā)以25℃最佳，芽管伸長(zhǎng)以30℃最適。液體培養(yǎng)，30℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)量最大。RH<80％時(shí)菌絲不能生長(zhǎng)，RH>80％時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率差異不大。分生孢子的萌發(fā)對(duì)濕度要求嚴(yán)格，僅在自由水和有水膜的情況下萌發(fā)。pH為3～11范圍內(nèi)均可營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，pH2～11范圍內(nèi)孢子均可萌發(fā)。液體培養(yǎng)條件下，適合營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的pH范圍為4～9，且在此范圍差異

4、不明顯。在一定范圍內(nèi)，酸性條件下孢子萌發(fā)率較堿性條件下萌發(fā)率高。在一定溫、濕度條件下，蘋(píng)果貯藏過(guò)程中炭疽病的發(fā)展曲線為不對(duì)稱S型，用岡珀茨模型（Gompertz model）進(jìn)行曲線擬合，模型擬合度達(dá)到極顯著水平。
　　 2．蘋(píng)果炭疽菌的分子鑒定和檢測(cè)結(jié)果表明，兩株病原菌Cg-1和Cg-2的ITS序列相似性達(dá)100％；二者與膠孢炭疽菌的相似性極高，達(dá)99.8％；與炭疽菌其它7個(gè)種的相似性相對(duì)較低，只有83.1％-98.5％；與不

5、同屬的鐮刀菌相似性最低，為68.9％。因此可以明確蘋(píng)果炭疽菌應(yīng)屬于膠孢炭疽菌。經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果炭疽菌的18S rDNA3’端比GenBank已登陸的2個(gè)膠孢炭疽菌多出一段379 bp的序列，將去除379 bp的蘋(píng)果炭疽菌rDNA序列與其它膠孢炭疽菌相比，序列相似性高達(dá)96.6％。根據(jù)這一特有片段設(shè)計(jì)特異性引物，結(jié)果儀能從蘋(píng)果炭疽菌中擴(kuò)增出1232 bp的特異性條帶。用蘋(píng)果炭疽菌接種離體蘋(píng)果，以接種發(fā)病的病組織總DNA為模板，利用引物

6、CgF1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同樣可以擴(kuò)增出1232 bp的特異性條帶，而健康蘋(píng)果組織DNA中未能擴(kuò)增出任何條帶，表明該方法可用于蘋(píng)果炭疽菌的鑒定和快速檢測(cè)。
　　 3．蘋(píng)果采后炭疽病的化學(xué)防治及控病機(jī)理研究結(jié)果表明，丙環(huán)唑、苯氧菌酯、撲海因、苯醚甲環(huán)唑和氟硅唑抑菌作用較強(qiáng)，代森錳鋅抑菌作用較弱。藥劑間對(duì)孢子萌發(fā)率和芽管伸長(zhǎng)抑制率差異顯著，其中撲海因、氟硅唑?qū)︽咦用劝l(fā)有抑制作用，抑制率分別為42.6％、48.3％。代森錳鋅、

7、丙環(huán)唑幾乎無(wú)抑制孢子萌發(fā)的作用，孢子萌發(fā)率為99.3％、98.2％。但丙環(huán)唑?qū)ρ抗苌扉L(zhǎng)能較好的抑制。活體試驗(yàn)表明：丙環(huán)唑、苯氧菌酯、嘧菌酯防效較好，其中丙環(huán)唑的防效達(dá)到100％。藥劑不同作用方式的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：浸果處理明顯好于噴霧。混劑以多菌靈+代森錳鋅（9：1，7：3）抑菌效果為最好，抑制菌絲生長(zhǎng)的共毒系數(shù)達(dá)到692.426、593.020?；铙w試驗(yàn)表明：混劑以多菌靈+代森錳鋅（9：1、7：3）防效為最好。
　　 4．鈣鹽對(duì)蘋(píng)

8、果炭疽病菌的抑制作用結(jié)果表明，CaCl2、Ca（NO3）2·4H2O和Ca（H2PO4）2對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的影響。Ca2+濃度為900μg/ml時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較小，Ca2+濃度高于1000μg/ml時(shí)能較好地抑制菌絲生長(zhǎng)，Ca2+濃度低于600μg/ml時(shí)有促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的趨勢(shì)。CaC12、Ca（NO3）2·4H2O和Ca，（H2PO4）2不能抑制分生孢子的萌發(fā)。鈣鹽對(duì)芽管伸長(zhǎng)的抑制作用，當(dāng)Ca2+濃度大于900μg/ml時(shí)Ca（NO

9、3）2·4H2O、CaCl2和Ca（H2PO4）2的抑制率分別為13.10％、45.75％和46.09％；當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí)，濃度處理之間的抑制作用差異不顯著。當(dāng)濃度小于600μg/ml時(shí)，對(duì)芽管的伸長(zhǎng)反而有一定的促進(jìn)作用。
　　 5．蘋(píng)果采后炭疽病生物防治及控病機(jī)理的研究結(jié)果表明，利用低能氮離子對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）進(jìn)行注入誘變，通過(guò)平板初篩出6株對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌有較好抑菌作用的菌株，經(jīng)蘋(píng)果果實(shí)活體測(cè)

10、定從中篩選對(duì)蘋(píng)果炭疽病有較好控病作用的菌株，從接種方式及病害發(fā)生的時(shí)間看，先接突變菌株的各處理發(fā)病時(shí)間均晚于先接病菌的處理，明顯推遲發(fā)病時(shí)間，表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)作用，低溫儲(chǔ)藏對(duì)病害發(fā)生的抑制作用更明顯。以先接突變菌株后控病效果較好的菌株按儲(chǔ)藏溫度的不同分為：室溫下的防治效果較好的菌株為BS80-6，14d時(shí)的防效為33.28％；低溫條件下BS100-1、BS100-6、BS80-6、BS120-8的效果較好，30d時(shí)的防效分別為98.36

11、％、95.36％、95.52％、93.52％；變溫下各菌株BS80-1、BS100-1、BS120-8的效果最好，30d的防效分別為84.59％、75.15％、72.40％。突變菌株三種處理液對(duì)病菌孢子萌發(fā)抑制作用以活菌液的效果最好，其次是濾液，高壓滅菌液的效果最差。經(jīng)平板濾紙片法和液體共培養(yǎng)法測(cè)定突變菌株對(duì)病菌菌絲的破壞作用的顯微鏡觀察結(jié)果表明，BS80-6菌株產(chǎn)生的抗生物質(zhì)抑制孢子萌發(fā)、使蘋(píng)果炭疽病菌菌絲體畸形，原生質(zhì)凝集，泡囊化。

12、同時(shí)對(duì)寄主防御酶（POD、PPO、PAL）活性的研究表明突變菌株能誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病性。
　　 6．熱處理與藥劑相結(jié)合、枯草芽孢桿菌濾液分別與Ca2+和苯氧菌酯配合使用的抑菌作用結(jié)果表明，熱處理與藥劑結(jié)合則能更好地控制病害，丙環(huán)唑和禾紋清在40℃作用下的效果最好，藥劑與熱處理相結(jié)合的防效大于藥劑單獨(dú)作用的防效?？莶菅挎邨U菌的濾液分別與Ca2+和苯氧菌酯配合使用的抑菌效果明顯好于單獨(dú)使用Ca2+和苯氧菌酯配的效果。其中濾液與苯氧菌酯

13、的配合使用的效果最佳，對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌的抑制效果達(dá)到58.2％。濾液與Ca2+混合使用抑制率達(dá)到32.9％，比單獨(dú)使用Ca2+的抑制效果提高了27.8％。濾液和Ca2+、苯氧菌酯結(jié)合使用在蘋(píng)果果實(shí)上的控制效果明顯好于單獨(dú)使用Ca2+、苯氧菌酯的效果。濾液與Ca2+結(jié)合控制效果提高了11.7％。
　　 7．蘋(píng)果炭疽菌低毒性菌株篩選及控病作用的研究結(jié)果表明，離子注入C100-2-5低毒株和磁場(chǎng)處理C0.25-1-2低毒株對(duì)蘋(píng)果有較好的

14、保護(hù)作用。離子誘變的低毒性菌株對(duì)蘋(píng)果炭疽病的控制效果達(dá)到55％左右。低毒性與強(qiáng)毒性菌株按不同比例混合接種蘋(píng)果的控制效果之間的差異顯著性不明顯，但都與單接種的強(qiáng)毒菌株達(dá)到顯著差異。菌株的毒性不同，引起果實(shí)體內(nèi)酶的活性變化也略有不同。測(cè)定低毒菌株rDNA序列，結(jié)果表明，引物CgF/CgR均可以擴(kuò)增出3156 bp的片段，且此段序列幾乎沒(méi)有發(fā)生變異。30條隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果表明低毒菌株與正常菌株RAPD擴(kuò)增多態(tài)性無(wú)明顯區(qū)別，未能發(fā)

15、現(xiàn)差異性，ISSR擴(kuò)增結(jié)果表明低毒菌株與正常菌株無(wú)明顯區(qū)別，20條引物未能發(fā)現(xiàn)差異性。
　　 8．采后蘋(píng)果與炭疽菌相互作用及生理機(jī)制研究結(jié)果表明，蘋(píng)果對(duì)炭疽菌抗性品種間差異極顯著（P=0.01），根據(jù)發(fā)病程度，其抗性可以分為四類：紅富士感病（S）；嘎啦、喬納金次之，中感（MS）；遼伏中抗（MR）；黃金帥果實(shí)發(fā)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)，抗?。≧）。初步明確了聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和羧甲基纖維素酶（Cx）在該菌侵染蘋(píng)果過(guò)程中起關(guān)鍵作用

16、。蘋(píng)果果實(shí)接種炭疽菌后β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性都被誘導(dǎo)提高，幾丁質(zhì)酶活性增幅高于β-1，3-葡聚糖酶，分別是對(duì)照的3-11倍和2-6倍。蘋(píng)果感染炭疽菌后，主要防御酶過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性變化與品種抗性有明顯相關(guān)性，表現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，抗病品種酶活始終高于感病和中感品種，接種前差異不顯著，接種后差異顯著，抗病品種酶活性升高幅度大，高峰出現(xiàn)的早，且一直保持在較高的水平。接種前，與品