紫花苜蓿單脫氫抗壞血酸還原酶基因MsMDAR的克隆及初步分析.pdf

1、基于基因在不同物種中的同源性設(shè)計引物，從紫花苜蓿中克隆出一段cDNA序列，經(jīng)在NCBI上進(jìn)行同源性比對和初步分析，推測該序列編碼單脫氫抗壞血酸還原酶，標(biāo)記為MsMDAR。該基因的編碼區(qū)全長1302bp，推測編碼434個氨基酸(Genebank登錄號：JN979555)。
　　 將MsMDAR的完整開放閱讀框(ORF)插入到原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，構(gòu)建融合表達(dá)載體pET-MDAR，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中用

2、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)物為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。SDS-PAGE分析表明該蛋白能在大腸桿菌中可以高效特異表達(dá)，產(chǎn)物大小與軟件預(yù)測結(jié)果相一致。將MsMDAR的ORF插入到表達(dá)載體pA7-GFP中，構(gòu)建融合表達(dá)載體MDAR-GFP。利用基因槍技術(shù)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度分布。結(jié)果表明，該蛋白定位于洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中。
　　 將MsMDAR的ORF插入到表達(dá)載體pBI121中，得到可以過量表達(dá)MsM

3、DAR的重組表達(dá)載體pBI-MDAR，采用凍融法將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，最后將鑒定結(jié)果為陽性的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草體內(nèi)，期望得到超表達(dá)MsMDAR的轉(zhuǎn)基因煙草。對再生植株進(jìn)行PCR、RT-PCR檢測以及GUS染色，最終確定2棵再生煙草苗為轉(zhuǎn)基因苗。利用pHANNIBAL中間載體和pART27表達(dá)載體，構(gòu)建MsMDAR基因的RNAi載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到苜蓿中，得到該基因表達(dá)受阻的苜蓿苗。對再生植株的PCR檢測結(jié)果顯示，約