大腸桿菌不耐熱腸毒素誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞因子變化規(guī)律研究.pdf

1、大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(ETEC)產(chǎn)生的一種能導(dǎo)致人或幼畜腸炎和腹瀉的毒性因子。是目前最強(qiáng)有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐劑之一,具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子。但由于其本身具有很強(qiáng)的腸毒性不宜直接使用,因此人們構(gòu)建了許多無毒或減毒突變體,其中雙突變體LTRG毒性比野生型LT低很多。本實(shí)驗(yàn)利用大腸桿菌表達(dá)的重組LT蛋白免疫小鼠或刺激小鼠巨噬細(xì)胞,采用建立的熒光定量 PCR方法分析了 LT黏膜佐

2、劑對小鼠體內(nèi)、及刺激細(xì)胞內(nèi)的6種細(xì)胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)采用液相芯片技術(shù)及流式細(xì)胞技術(shù),分析了LT蛋白作用下巨噬細(xì)胞內(nèi)這6種細(xì)胞因子的表達(dá)及T淋巴細(xì)胞的變化。
　　不同劑量的LTRG蛋白作用體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞,結(jié)果1ug/ml的LTRG蛋白對巨噬細(xì)胞的刺激效果最明顯,對IL-1β和IL-4細(xì)胞因子變化最顯著。檢測LT蛋白處理的小鼠巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量

3、變化,結(jié)果顯示野生型LT組IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量分別在免疫后2h、4h和12h達(dá)到峰值,與對照組差異極顯著(p<0.01);IL-12、IFN-γ、IL-4的mRNA表達(dá)量在免疫后24h達(dá)到最大值,與對照組差異極顯著(p<0.01)。PBS對照組細(xì)胞因子無顯著變化。突變型LTRG組細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量在免疫后達(dá)到峰值的時(shí)間與野生型LT組相比有不同程度的延遲。
　　為了進(jìn)一步了解LTRG蛋白對共免疫原的

4、作用,采用LTRG與BSA共免疫小鼠巨噬細(xì)胞,結(jié)果顯示LTRG和BSA協(xié)同處理后大多數(shù)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)量在12h達(dá)到高峰,與單獨(dú)使用BSA組差異極顯著(p<0.01);TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量分別在免疫后8h和24h達(dá)到峰值,與BSA組差異極顯著(p<0.01)。BSA對照組細(xì)胞因子無顯著變化。通過液相芯片技術(shù)分析LT對巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響,由于細(xì)胞上清液中蛋白含量比較低,只檢測到TNF-α和IL-6的濃度,結(jié)果顯

5、示LTRG蛋白處理后TNF-α和IL-6的濃度分別在36h和48h達(dá)到最大值,與PBS對照組差異極顯著(p<0.01);LTRG與BSA共免疫后TNF-α和IL-6的濃度在24h達(dá)到最大值,與BSA對照組差異極顯著(p<0.01)。以上結(jié)果表明LT可以激活小鼠巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng),執(zhí)行抗原遞呈功能,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并且可以協(xié)同抗原提高免疫效果。
　　LT免疫小鼠實(shí)驗(yàn)中檢測發(fā)現(xiàn),野生型LT和突變型LTRG蛋白組的各細(xì)

6、胞因子分別在免疫后48h和60h左右,小鼠脾臟中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量達(dá)到最大值,與對照組差異極顯著(p<0.01)。PBS對照組細(xì)胞因子無顯著變化。表明LT及LTRG蛋白都能通過誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,刺激高水平細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測 LT、LTRG蛋白免疫后小鼠脾臟組織中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞的變化。結(jié)果顯示,LT和LTRG蛋白免疫小鼠后脾臟中CD4+和CD

7、8+T淋巴細(xì)胞比例相比對照組顯著提高。表明,LT、LTRG刺激作用顯著提高了小鼠的T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。
　　綜上,本研究從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平對LT免疫后細(xì)胞、小鼠體內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子的變化規(guī)律進(jìn)行了研究,證明LTRG蛋白能夠誘導(dǎo)Th1、Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng),產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫,產(chǎn)生針對 LTRG蛋白抗原的非特異性免疫應(yīng)答。并能提高共免疫原的免疫效果,促使機(jī)體特異性T細(xì)胞明顯增多。且LTRG蛋白對Th1、Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)的促進(jìn)作用