重組大腸桿菌不耐熱腸毒素及其無毒衍生物的構(gòu)建和表達.pdf

1、本研究應(yīng)用PCR的方法獲得我國人源ETEC標(biāo)準(zhǔn)菌株E44815的elt基因和eltB基因，又通過重疊延伸定點誘變的方法將LTA亞基63位絲氨酸密碼子突變?yōu)榫幋a賴氨酸的密碼子，構(gòu)建突變體mLT63的基因。將獲得的三個基因片段分別重組于原核表達載體，構(gòu)建了LT、突變體mLT63、無毒亞單位LTB三個蛋白的原核表達系統(tǒng)；通過Westernblot方法鑒定三種蛋白的表達及免疫反應(yīng)活性。以期構(gòu)建無毒又保持LT免疫活性的粘膜佐劑候選株，并進一步研究

2、LT的免疫機理及其在基因工程疫苗研制上的應(yīng)用。結(jié)論：L成功構(gòu)建了我國ETEC人源標(biāo)準(zhǔn)菌株E44815elt、eltB和mlt63基因的重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)序列分析證實所克隆基因及構(gòu)建的定點誘變基因正確。2.生物信息學(xué)分析顯示mLT63在LT毒力中心的二級結(jié)構(gòu)和抗原性都有顯著改變，很有可能使其毒性降低或完全去除。LT、LTB和突變體mLT63具有很高的抗原活性，且人源、豬源和禽源LT具有較高的保守性，理論上支持LTs作為疫苗和免疫佐劑的可行性

3、及應(yīng)用的廣泛性。3.所構(gòu)建的三個原核溫控表達系統(tǒng)DH5α(pBV-elt)、DH5α(pBV-eltB)和DH5α(pBV-mlt63)主要以包涵體形式表達三種目的蛋白，但表達量較低，不便于進一步純化。4.原核融合表達系統(tǒng)TB1(pMAL-lt)、TB1(pMAL-ltB)和TB1(pMAL-mlt63)具有較高的表達效率，表達的重組蛋白易于純化，是制備LTs研究其生物活性和疫苗應(yīng)用價值的理想工具，可作為研制ETEC基因工程疫苗抗原和多