大腸桿菌不耐熱腸毒素2型突變體的構(gòu)建及其抗原性研究.pdf

1、犢牛大腸桿菌性腹瀉是對新生幼犢造成侵害的一種急性傳染病，由致病性大腸桿菌引發(fā)，按疾病嚴(yán)重程度分別表現(xiàn)為消化不良、發(fā)熱、廢食、氣短、腹瀉、自體中毒及心力衰竭。犢牛大腸桿菌性腹瀉主要致病因子有腸毒素、黏附素和志賀毒素。不耐熱腸毒素Ⅱ型是導(dǎo)致犢牛腹瀉的病原之一。國內(nèi)外對于LT-Ⅱ的研究并不廣泛，探索LT-Ⅱ點(diǎn)突變后的毒性改變對深入研究LT-Ⅱ的致病性分子機(jī)制和弱毒疫苗研制均具有重要意義。
　　本研究通過查閱文獻(xiàn)，參考LT-Ⅱ a和LT-

2、Ⅱ b編碼基因關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的功能，推測rLT-Ⅱc1B亞基氨基酸第13、14位點(diǎn)為與特異性受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。采用融合PCR的方法將第13、14位蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?T13I，T14I)，將突變后基因片段最終轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)毒素突變體rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)，將rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)突變蛋白、未突變重組蛋白rLT-Ⅱc1、野生毒素LT-Ⅱc1分別輔以佐劑，肌肉注射免疫小鼠、家兔，通過間接ELISA技術(shù)測定

3、特異性IgG水平，使用Y-1細(xì)胞檢測rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)、rLT-Ⅱc1、LT-Ⅱc1對細(xì)胞最低致死毒性，通過體外中和實(shí)驗(yàn)檢測中和效價(jià)以及交叉中和效價(jià)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)獲得了高效表達(dá)。間接ELISA檢測結(jié)果表明，各免疫組經(jīng)過相應(yīng)抗原免疫刺激后所表現(xiàn)的抗體效價(jià)有所不同，在35d時(shí)抗體水平上升至最高并與對照組相比有顯著性差異。其中rLT-Ⅱc1效價(jià)可達(dá)到1∶6400、rLT-Ⅱc

4、1(T13I-T14I)效價(jià)為1∶5000、天然毒素效價(jià)為1∶6400。細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)、rLT-Ⅱc1、LT-Ⅱc1都可以使Y-1小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯的病變，rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)突變蛋白細(xì)胞最小致死量為3.52×10-6mg/mL、rLT-Ⅱc1細(xì)胞最小致死量為17.8pg、LT-Ⅱc1為4.87×10-11mg/mL。根據(jù)中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過Reed-Mouch計(jì)算rLT-Ⅱc

5、1免疫血清對rLT-Ⅱc1蛋白的中和效價(jià)為1∶89，對rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)蛋白中和效價(jià)為1∶62; rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)免疫血清對rLT-Ⅱc1蛋白的中和效價(jià)為1∶45，對rLT-Ⅱc1(T13I-T14I)蛋白中和效價(jià)為1∶35。
　　研究表明，突變體仍然具有免疫活性，突變后對Y-1細(xì)胞最小致死量為3.52×10-6mg/mL，毒性降低，體外中和實(shí)驗(yàn)顯示兩種免疫血清對彼此有中和作用。該研究為探索L