重組大腸桿菌不耐熱腸毒素Ⅱ型蛋白部分生物活性研究.pdf

1、犢牛大腸桿菌性腹瀉是由致病性大腸桿菌引起的新生幼犢的一種急性傳染病，主要表現(xiàn)為腹瀉，嚴(yán)重者因功能衰竭、脫水和酸中毒而死亡，也有的表現(xiàn)為敗血癥癥狀，常給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起犢牛腹瀉的大腸桿菌主要毒力因子有腸毒素（不耐熱腸毒素和耐熱腸毒素）、志賀毒素和黏附素，其中不耐熱腸毒素Ⅱ型(TypeⅡ heat-labile enterotoxin，LT-Ⅱ)可引起犢牛嚴(yán)重的腹瀉。國(guó)內(nèi)外對(duì)于LT-Ⅱ相關(guān)研究較少，因此，深入研究LT-Ⅱ的生物

2、學(xué)活性可對(duì)防治大腸桿菌性犢牛腹瀉具有重要意義，為犢牛大腸桿菌性腹瀉疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　本研究通過(guò)對(duì)2010-2012年?yáng)|北地區(qū)12個(gè)規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)犢牛腹瀉糞便中分離的381株大腸桿菌樣品進(jìn)行LT-Ⅱ基因的PCR檢測(cè)，有10株大腸桿菌帶有LT-Ⅱ基因。核苷酸序列分析結(jié)果顯示，8株為L(zhǎng)T-Ⅱcl基因、1株為L(zhǎng)T-Ⅱc4基因、1株為L(zhǎng)T-Ⅱc6基因。將優(yōu)勢(shì)基因型LT-Ⅱcl毒素基因雙順?lè)醋拥腛RF克隆入pET30a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化Ros

3、satta感受態(tài)細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)rLT-Ⅱcl重組蛋白，同時(shí)構(gòu)建了LT-ⅡclA、B亞基的原核表達(dá)系統(tǒng)BL21/pHUE-LT-Ⅱcl-A、BL21/pHUE-LT-Ⅱcl-B和BL21/pGEX-6p-1-LT-Ⅱcl-B，并對(duì)應(yīng)表達(dá)rLT-Ⅱcl-A、rLT-Ⅱcl-B和rpLT-Ⅱcl-B。用Y-1細(xì)胞檢測(cè)rLT-Ⅱcl對(duì)細(xì)胞的毒性作用。將rLT-Ⅱcl、rLT-Ⅱcl-A、rLT-Ⅱcl-B三種重組蛋白與白油佐劑1∶1混合后，分別

4、進(jìn)行腹腔注射和滴鼻免疫6周齡小鼠，用間接ELISA定期檢測(cè)血清中特異性IgG和IgA抗體水平;Y-1細(xì)胞體外中和試驗(yàn)檢測(cè)高效價(jià)小鼠血清的中和效價(jià)。選取8月齡海蘭褐蛋雞，用以上三種抗原進(jìn)行胸肌注射免疫，定期收集雞蛋，用間接ELISA檢測(cè)卵黃抗體效價(jià);Y-1細(xì)胞體外中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高價(jià)卵黃抗體中和效價(jià)。
　　SDS-PAGE分析和Western blot鑒定結(jié)果顯示，以上四種重組蛋白均獲得高效表達(dá)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示，rLT-Ⅱcl可以使Y

5、-1小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞發(fā)生明顯的病變，其細(xì)胞最小致死量為17.8pg。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在腹腔注射途徑中，rLT-Ⅱcl免疫組小鼠血清中特異性IgG效價(jià)水平最高，A亞基效價(jià)為1∶10610、B亞基效價(jià)為1∶14400，高于其他免疫組;在滴鼻免疫組中，LT-Ⅱcl重組蛋白組小鼠血清中特異性IgA效價(jià)也為最高，A亞基滴度為1∶3400、B亞基滴度為1∶3600，同樣也高于其他免疫組各組。體外中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射組中rLT-Ⅱ

6、cl組小鼠血清抗體中和效價(jià)為1∶52。在三種免疫原免疫蛋雞后均在三免后14d卵黃抗體水平達(dá)到最高，其中rLT-Ⅱcl組卵黃抗體水平較高，A亞基為1∶6120、B亞基為1∶8630;重組蛋白B亞基組卵黃抗體效價(jià)高達(dá)1∶9670;重組蛋白A組卵黃抗體效價(jià)僅為1∶3600;各組高效價(jià)卵黃抗體體外中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，rLT-Ⅱcl組中和效價(jià)為1∶24;rLT-Ⅱcl-A組中和效價(jià)為1∶7; rLT-Ⅱcl-B組中和效價(jià)為1∶19。
　　研究