家蠶基因Cameo2與CBP對葉黃素轉運的功能初探.pdf

1、家蠶繭中的色素來自桑葉,經蠶食下后,由中腸上皮細胞吸收,通過中腸進入血淋巴,最后進入絲腺,在絲膠層積累,使繭絲著色。由于繭絲中色素的種類,含量和分布的不同,產生了各種繭色。家蠶黃紅繭系形成主要色素為類胡蘿卜素,包括葉黃素,β-胡蘿卜素,α-胡蘿卜素和紫黃質。對黃紅繭系中繭色形成研究比較深入的是黃繭形成機理,黃繭中主要色素是葉黃素,其次是β-胡蘿卜素,涉及Y,I,C三個基因的調控。Y基因為黃血基因,控制中腸上皮細胞對類胡蘿卜素的吸收,可使

2、血液著色;I基因為黃血抑制基因,控制類胡蘿卜素由中腸到血液的轉運;C基因控制類胡蘿卜素由血液進入絲腺,使絲腺著色。Y,I,C分別對+Y,+I,+C為顯性。只有Y+IC的基因組合才能形成黃色繭,其中Y基因編碼CBP,Cameo2受C基因控制。
　　 CBP序列中含一個START結構域,CBP蛋白能與葉黃素以1:1的摩爾比結合。在哺乳動物中,START結構域與膽固醇,磷脂酰膽堿,神經酰胺,葉黃素等多種脂類物質的結合及代謝相關。傳統(tǒng)遺

3、傳分析認為Y基因主要是控制家蠶的中腸類胡蘿卜素的吸收,而新的研究表明Y基因產物CBP,在黃繭N4品種的中腸和絲腺均有蛋白表達,即其可能在中腸和絲腺均與類胡蘿卜素的吸收轉運有關。此外,Y基因在黃紅繭系多種繭色的形成中起關鍵作用,可能涉及不同類胡蘿卜素的轉運調控,因此,CBP也可能與多種類胡蘿卜素轉運相關。
　　 Cameo2為CD36基因家族基因,與哺乳動物SR-BⅠ和果蠅ninaD同源。SR-BⅠ在哺乳動物中作為高密度脂蛋白受體

4、,參與膽固醇,葉黃素,玉米黃素,β-胡蘿卜素,維生素E等多種脂類的吸收轉運。ninaD在果蠅細胞中參與細胞對葉黃素,玉米黃素,β-胡蘿卜素的吸收。Cameo2在中腸和絲腺均有mRNA轉錄表達。
　　 Y基因產物CBP和C基因產物Cameo2在家蠶類胡蘿卜素選擇性轉運的兩個關鍵部位,中腸和絲腺均有蛋白表達或mRNA轉錄表達,他們的同源基因或保守結構域在其他物種中都與脂類的轉運密切相關,Y基因又在黃紅繭系多種繭色形成過程中扮演關鍵作

5、用,那么在黃繭家蠶主要繭色色素(葉黃素和β-胡蘿卜素)轉運過程中,CBP和Cmaoe2是否單獨能夠行使吸收轉運功能?兩者在類胡蘿卜素的轉運過程中是否存在協(xié)同作用?如果存在協(xié)同作用關系,兩者是否具有蛋白質問的相互作用?Cmaoe2基因組上的同源串聯(lián)基因Cameo1是否也與類胡蘿卜素轉運有關?本文針對以上問題,進行研究,得到了以下研究結果。
　　 1.Cameo1,Cameo2與CBPmRNA轉錄表達與家蠶葉黃素轉運相關性
　

6、　 取不同繭色品種家蠶繭色形成關鍵時期的組織,末齡3-6天的中腸和絲腺,提取RNA,反轉錄成cDNA,RT-PCR檢測Cameol,Cameo2與CBP的mRNA轉錄表達與葉黃素轉運相關性。
　　 結果顯示,以葉黃素為主要繭色形成色素的家蠶品種(03-210、柬埔寨和02.320)中,Cameol,Cameo2與CBPmRNA在中腸和絲腺中同時轉錄,在其他不是以葉黃素為主要繭色形成色素的家蠶品種(03-520、大造和秋白)中,

7、Cameol,Cameo2與CBP不是同時在中腸和絲腺中轉錄,暗示Cameol,Cameo2與CBP這3個基因可能同時參與家蠶黃紅繭形成過程中葉黃素在中腸和絲腺的轉運。
　　 2.家蠶類胡蘿卜素轉運相關蛋白在細胞水平對類胡蘿卜素吸收轉運的影響
　　 將Cameo1,Cameo2,CBP,cbp(CBP缺失型)分別構建真核表達載體,轉染HEK293細胞,對其進行細胞定位。結果顯示,Cameo1和Cameo2定位在細胞質膜區(qū)

8、域,CBP和cbp則分布在整個細胞。在單獨轉染和組合共轉染細胞分別與含有葉黃素和β-胡蘿卜素微粒的培養(yǎng)液孵育后,收集并破碎細胞,提取類胡蘿卜素,HPLC檢測細胞內類胡蘿卜素含量。檢測結果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,結果顯示,共表達Cameo2+CBP細胞葉黃素積累量是表達EGFP對照組的2.71倍,差異極顯著(P=0＜0.01),且細胞葉黃素積累量具飽和性和濃度依賴性特點,這表明共表達Cameo2+CBP細胞對葉黃素的轉運為

9、細胞載體介導。表達以上蛋白的細胞,與表達EGFP對照組相比,細胞內β-胡蘿卜素含量并無顯著差異(P＞0.05),表明以上幾種蛋白對β-胡蘿卜素沒有相應的轉運功能。
　　 3.家蠶類胡蘿卜素轉運相關蛋白相互作用的初步檢測
　　 運用BiFC(雙分子熒光互補技術),將Cameo1和Cameo2分別構建到載體pBiFC-VC155(HA-CMVbackbone)上,CBP和cbp分別構建到載體pBiFC-VN173(FLAG-

10、CMVbackbone)上,然后將Cameo1與CBP,Cameo2與CBP,Cameo1與cbp,Cameo1與cbp組合,共轉染HEK293細胞。熒光顯微鏡觀察顯示CBP與Cameo1,CBP與Cameo2在細胞質膜區(qū)域可能有蛋白相互作用或者空間上的相互靠近。
　　 綜合RT-PCR實驗,瞬時轉染HEK293細胞色素孵育實驗和BiFC實驗結果,得出以下結論:Cameo2與CBP在可能同時在家蠶中腸和絲腺參與葉黃素的轉運;Ca

11、meo2與CBP在細胞質膜區(qū)域可能具有蛋白間相互作用或者空間上的相互靠近;兩者可協(xié)同作用將葉黃素跨膜轉運,由細胞外轉運到細胞內。
　　 我們推測在色素轉運過程中,Cameo2可能在細胞膜上起“捕獲”葉黃素的作用,葉黃素隨后被轉移到細胞內,傳遞給細胞內的葉黃素結合蛋白CBP,使其在細胞內直接行使生理功能、積累或者進一步轉運;Cameo2和CBP在細胞質膜區(qū)域的相互作用或者空間上的相互靠近可能起到傳遞脂類(葉黃素)的作用;在家蠶黃繭