甘藍(lán)春化相關(guān)基因BoVIN3的克隆及分析.pdf_第1頁
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1、結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea var.captata L.)屬于綠體春化型植物,幼苗需長(zhǎng)到一定大小,方能感應(yīng)低溫通過春化[1]。長(zhǎng)時(shí)間低溫處理促進(jìn)植物開花的過程稱為春化作用,在植物成花轉(zhuǎn)變過程中起著重要的作用,該領(lǐng)域的研究近年來己取得了較大的進(jìn)展,特別是對(duì)春化的分子機(jī)理探討方面也逐漸凸顯出其本質(zhì),雖然對(duì)春化作用機(jī)理的理解呈現(xiàn)出一些輪廓,但春化作用分子調(diào)控的過程卻還很不清楚。
   根據(jù)擬南芥及其蕓薹屬相關(guān)領(lǐng)域的研

2、究報(bào)道,本試驗(yàn)重點(diǎn)針對(duì)開花網(wǎng)絡(luò)核心基因FLC及其春化作用途徑上游的關(guān)鍵基因VIN3進(jìn)行研究,首次從十字花科蕓薹屬作物結(jié)球甘藍(lán)中克隆了春化相關(guān)基因VIN3,通過生物軟件對(duì)VIN3基因進(jìn)行了序列分析,并通過RT-PCR方法檢測(cè)在結(jié)球甘藍(lán)中的表達(dá)情況及其與春化作用的關(guān)系,以為研究結(jié)球甘藍(lán)綠體春化的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)主要研究結(jié)果如下:
   本試驗(yàn)中對(duì)自然條件下生長(zhǎng)的甘藍(lán)幼苗可以感受低溫春化的形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)研究表明:甘藍(lán)中熟品種“光

3、榮一號(hào)”可以感受低溫春化的低限苗齡為13片葉,莖粗達(dá)到12.83±0.14mm,低溫處理48 d春化作用結(jié)束,開始進(jìn)入花芽分化臨界期。甘藍(lán)植株只有接受低溫誘導(dǎo)達(dá)到春化飽和程度才能啟動(dòng)相應(yīng)基因表達(dá),所以本試驗(yàn)需采用可以感受低溫春化的幼苗進(jìn)行春化處理,以備下一步克隆春化相關(guān)基因VIN3。
   根據(jù)擬南芥VIN3基因的mRNA序列(NM-125121.3)的ORF編碼區(qū),設(shè)計(jì)了VIN3基因的特異引物,以甘藍(lán)RNA及DNA為模板克隆B

4、oVIN3基因的cDNA和DNA序列。克隆得到兩條甘藍(lán)春化相關(guān)基因BoVIN3的cDNA ORF編碼區(qū)序列,各1680 bp,GenBank登錄號(hào)分別為JQ394927和JQ394928,可編碼由560個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì);與擬南芥VIN3基因在核酸水平上同源性分別達(dá)到85.55%和79.95%;與擬南芥氨基酸序列同源性分別為80.72%和72.96%。同時(shí)獲得BoVIN3基因的部分基因組片段,1405bp,GenBank登錄號(hào)為JQ3

5、94929。
   利用DNAMAN等軟件以及在線分析程序?qū)oVIN3基因及其編碼的蛋白進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,甘藍(lán)BoVIN3-1、BoVIN3-2蛋白長(zhǎng)度均為560AA,分子量約分別為62.116KD和62.434KD,等電點(diǎn)分別為6.56和5.63;通過磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)其蛋白存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn);通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)程序得知該蛋白具有PHD結(jié)構(gòu)域。
   半定量RT-PCR表達(dá)分析表明BoVIN3受春化作用的

6、誘導(dǎo),只在感應(yīng)低溫的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)表達(dá),在其它部位不表達(dá),并且其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物隨春化時(shí)間延長(zhǎng)逐漸積累,在春化42 d時(shí)達(dá)到峰值;而在不同濃度GA3和KT誘導(dǎo)下不表達(dá);FLC受春化作用的抑制,并且BoVIN3受誘導(dǎo)表達(dá)后才能使FLC的表達(dá)受到抑制,暗示在結(jié)球甘藍(lán)中BoVIN3基因可能參與春化調(diào)控開花的生物學(xué)過程,屬于春化特異基因,只響應(yīng)低溫誘導(dǎo)而轉(zhuǎn)錄。
   以pBI121植物表達(dá)載體和BoVIN3-1基因片段為基礎(chǔ),構(gòu)建反義植物表達(dá)載體。

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