基于轉(zhuǎn)錄激活的細(xì)菌雙雜交載體的構(gòu)建.pdf

1、大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)是繼酵母雙雜交系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交系統(tǒng)之后，產(chǎn)生的另一種直接于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的遺傳學(xué)新方法。本研究希望構(gòu)建基于轉(zhuǎn)錄激活的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)載體，并且進(jìn)一步發(fā)展高通量的細(xì)菌雙雜交載體。其主要內(nèi)容： (1)將細(xì)菌雙雜交誘餌載體pBT、獵物載體pTRG的克隆方式進(jìn)行改進(jìn)。最初的系統(tǒng)是BacterioMatch(R)Ⅱtwohybridsystem，為了能高通量地將誘餌、獵物基因克隆到相應(yīng)載體上，而且

2、能利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的大量引物，將兩載體作出了改進(jìn)：在多克隆位點(diǎn)處兩端依次引入現(xiàn)有引物中的長(zhǎng)15bp的同源序列BF、NR，兩個(gè)酶切位點(diǎn)BglⅡ、NotⅠ，中間為一個(gè)帶強(qiáng)啟動(dòng)子Prrn的gfp作為反選擇標(biāo)記。改進(jìn)的誘餌載體和獵物載體分別命名為pBT-BN-GFP，pTRG-BN-GFP。 基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，與用BglⅡ、NotⅠ酶切的誘餌載體混合，無需用連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。多基因可以平行操作，無需考慮基因內(nèi)的酶