解淀粉芽孢桿菌NC6蛋白激發(fā)子PeBA1的分離鑒定及功能研究.pdf

1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是植物根際生長(zhǎng)促進(jìn)菌中非常重要的一類生防菌。研究表明，芽孢桿菌生防機(jī)制主要包括：競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、誘導(dǎo)抗病性及促進(jìn)生長(zhǎng)等4個(gè)方面。目前尚未有關(guān)于解淀粉芽孢桿菌大分子蛋白激發(fā)子的報(bào)道，本研究首次從解淀粉芽孢桿菌 NC6菌株中分離純化出一種能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病反應(yīng)的新型蛋白激發(fā)子PeBA1，為進(jìn)一步闡述解淀粉芽孢桿菌誘導(dǎo)抗病性提供一定的理論基礎(chǔ)。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果如下：

2、r>　　1.蛋白激發(fā)子的分離純化及質(zhì)譜分析
　　通過(guò)硫酸銨沉淀，陰離子柱交換層析，以及活性膠回收等一系列蛋白純化方法，從解淀粉芽孢桿菌 NC6菌株中獲得一種能夠誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生典型過(guò)敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)激發(fā)子。并對(duì)該激發(fā)子進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得其氨基酸序列，并命名為 PeBA1（ Protein elicitor from Bacillus amyloliquefaciens1）。
　　2.構(gòu)建PeBA1原核表達(dá)及純化系統(tǒng)
　　

3、克隆PeBA1基因，并將目的基因與原核表達(dá)載體E1連接，最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞超聲破碎，Ni柱親和層析，超濾除鹽濃縮獲得高濃度PeBA1重組蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)及誘導(dǎo)煙草葉片過(guò)敏性壞死活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證原核表達(dá)的準(zhǔn)確性。
　　3.PeBA1的理化性質(zhì)及誘導(dǎo)煙草防御反應(yīng)
　　進(jìn)一步研究 PeBA1重組蛋白的理化性質(zhì)及誘導(dǎo)煙草防御反應(yīng)。PeBA1重組蛋白能夠在4、25、50

4、、80、100℃水浴中孵育15min后保持良好的穩(wěn)定性。其所能夠引起枯斑三生煙煙草葉片過(guò)敏性壞死反應(yīng)的最低濃度為5μM。PeBA1重組蛋白能夠誘導(dǎo)煙草防御早期事件如活性氧爆發(fā)（包括過(guò)氧化氫、超氧負(fù)離子的產(chǎn)生）。同時(shí)PeBA1重組蛋白可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，包括大量的酚類物質(zhì)形成等，其能夠增強(qiáng)細(xì)胞壁強(qiáng)度，阻止病原菌的侵染。
　　4.PeBA1誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性
　　通過(guò)誘導(dǎo)煙草抗病性測(cè)試，我們發(fā)現(xiàn) PeBA1重組蛋

5、白能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對(duì)灰霉病菌和煙草花葉病毒的抗性。PeBA1重組蛋白處理的煙草葉片接種灰霉菌后，病斑直徑明顯小于蛋白緩沖液處理組，PeBA1處理的煙草葉片接種TMV后所引起病斑數(shù)和病斑大小均少于或小于緩沖液處理，證明 PeBA1重組蛋白能夠誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PeBA1重組蛋白處理煙草，能夠誘導(dǎo)水楊酸途徑相關(guān)抗病性基因如PR1a、PR1b和PR5和PAL，以及茉莉酸途徑相關(guān)部分抗病性基因如 COI1和 PDF1.2的