擴(kuò)展青霉脂肪酶的定點(diǎn)突變及隨機(jī)突變.pdf

1、本研究利用定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變的技術(shù)手段，對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶(Penicilliumexpansumlipase，PEL)進(jìn)行了最適作用溫度、高溫穩(wěn)定性及低溫適應(yīng)性的蛋白質(zhì)工程改造，結(jié)果如下：1、PEL基因的定點(diǎn)突變采用重疊延伸PCR的方法對(duì)PEL基因進(jìn)行了E83V、T88P、K226R、E54P的定點(diǎn)突變，利用大引物PCR的方法進(jìn)行了E214P的突變。突變基因在畢赤酵母GS115中表達(dá)，對(duì)突變體的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明：突變

2、體PEL-E83V-GS的最適作用溫度提高了5.0℃，其比活約為野生型的2倍，熱穩(wěn)定性略有下降。說明了突變后疏水性較強(qiáng)的氨基酸Val可能增加了酶分子的表面疏水性，從而提高酶分子的疏水性包裝效率；突變體PEL-E214P-GS的最適作用溫度比野生型提高了7.5℃，熱穩(wěn)定性也提高了2.4℃，體現(xiàn)了Pro對(duì)熱穩(wěn)定性的特殊貢獻(xiàn)；突變體PEL-T88P-GS的最適作用溫度比野生型提高了2.5℃，但熱穩(wěn)定性無(wú)明顯變化，而點(diǎn)E54P突變后則完全失去酶

3、活；突變體PEL-K226R-GS的最適作用溫度比野生型提高了5.0℃，但熱穩(wěn)定性和酶活有所下降。說明了Arg替換Lys后，脂肪酶與底物可能形成了額外的氫鍵，但同時(shí)也可能形成了空間位阻。2、PEL基因的隨機(jī)突變用易錯(cuò)PCR的定向進(jìn)化技術(shù)手段對(duì)PEL基因進(jìn)行了隨機(jī)突變，PCR產(chǎn)物與載體pPIC3.5K構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌構(gòu)建突變文庫(kù)。突變文庫(kù)的混合質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過對(duì)7000個(gè)重組菌的篩選，第一輪篩選出60個(gè)克隆子，然后進(jìn)