單shRNA介導(dǎo)的對(duì)馬鈴薯Y病毒與煙草蝕紋病毒抗性研究.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）是植物病毒中最大的屬，有大約200種確定和可能的種，能侵染茄科、藜科、豆科、葫蘆科等多種植物。馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV）是馬鈴薯Y病毒屬的兩種典型病毒。RNA介導(dǎo)的病毒抗性（RNA-Mediated Virus Resistance，RMVR）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的抗病毒基因工程策略，具有抗病程度高（近乎免疫）

2、、抗性持久、生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)。RNA介導(dǎo)的抗性也存在著一定的局限性，即抗性譜較窄，但這種局限性可以用同時(shí)表達(dá)多個(gè)不同的病毒RNA序列所彌補(bǔ)，所以可以把不同病毒的有效核酸片段連接起來(lái)轉(zhuǎn)化植物，獲得多抗植株。RNA沉默為序列依賴性的基因沉默，利用RNA沉默培育多抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的另一條策略是基于不同病毒（病毒株系）間存在相對(duì)保守的序列。本研究通過(guò)比較PVYN株系和TEV-SD1株系的基因組序列，篩選出高相似符合siRNA特征的9個(gè)靶位點(diǎn)序

3、列，分別構(gòu)建了shRNA結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草。我們發(fā)現(xiàn)利用單shRNA可獲取多抗病毒植株，但是抗性與相似性并不呈完全正相關(guān)，不同點(diǎn)堿基對(duì)靶序列識(shí)別的貢獻(xiàn)差異性。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明RNA介導(dǎo)基因沉默（病毒抗性）產(chǎn)生的機(jī)制，尋找高相似靶序列，及利用該策略培育多抗病毒（株系）轉(zhuǎn)基因植物提供依據(jù)。研究結(jié)果和主要結(jié)論如下：
　　 （1）從山東感病的煙草中首次分離得到煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus，TEV），命

4、名為T(mén)EV-SD1。5' RACE（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）及RT-PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）克隆TEV總基因組。測(cè)序結(jié)果表明，TEV-SD1基因組cDNA含有9414個(gè)核苷酸（GenBank Acc.No.:EF470242），編碼3053個(gè)氨基酸。
　　 （2）通過(guò)PVYN與TEV-SD1序列相似性比對(duì)，參考siRNA的相關(guān)準(zhǔn)

5、則，選出9個(gè)特征明顯的靶序列。設(shè)計(jì)9對(duì)引物，退火合成dsDNA；插入到經(jīng)BamHⅠ+KpnⅠ雙酶切的pROKⅡ空載體中，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選并獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pR-NIB-P1、pR-NIB-P2、pR-HC-P3、pR-HC-P4、pR-CI-P5、pR-CI-P6、pR-HC-P7、pR-NIB-P8和pR-VPG-P9。酶切鑒定表明成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體。
　　 （3）將成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體利用凍融法直接導(dǎo)入

6、農(nóng)桿菌EHA105。瞬時(shí)侵染本生煙，用含PVYN的病汁液摩擦接種，及siRNA的雜交分析，結(jié)果證實(shí)shRNA能夠表達(dá)生成特異siRNA。
　　 （4）將成功構(gòu)建的植物表達(dá)載體利用凍融法直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草NC89。再生植株經(jīng)卡那霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化pR-NIB-P1、pR-NIB-P2、pR-HC-P3、pR-HC-P4、pR-CI-P5、pR-CI-P6、pR-HC-P7、pR-NI

7、B-P8和pR-VPG-P9分別獲得86、106、104、111、80、99、114、86和93株T0代轉(zhuǎn)基因植株。
　　 （5）用含PVYN的病汁液分別摩擦接種9轉(zhuǎn)基因種煙草，抗病率分別為65.12％、50.49％、11.54％、45.95％、17.50％、21.21％、42.11％、53.49％、22.58％。用含TEV-SD1的病汁液摩擦分別接種9種無(wú)性擴(kuò)繁抗PVYN的煙草，抗病率分別為41.86％、50.94％、7.69

8、％、40.54％、15.00％、18.18％、28.94％、44.19％、19.35％。說(shuō)明序列相似性在85.71％以上都能介導(dǎo)抗性，但是抗性與相似性并不呈完全正相關(guān)。
　　 （6）轉(zhuǎn)基因植株的Northern blot分析表明，轉(zhuǎn)基因都在RNA水平上得到了表達(dá)，抗病植株中RNA的積累量明顯低于同類型的感病植株，抗性與RNA積累量呈負(fù)相關(guān)；抗病轉(zhuǎn)基因植株中有siRNA存在，表明病毒抗性是由RNA介導(dǎo)的。
　　 （7）通過(guò)