馬鈴薯卷葉病毒重組CP的獲得及其多克隆抗體的制備.pdf

1、本研究的目的是先進行馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)外殼蛋白(CP)基因酵母與原核表達效果的比較，獲得大量重組CP，然后以重組CP為抗原制備特異性抗血清、獲得多克隆抗體與酶標記抗體，為進行PLRV的DAS-ELISA檢測試劑盒的制備奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、以lacZ為標記基因、INVScl為受體菌研究了釀酒酵母表達系統(tǒng)的有效性。用LIAc法獲得了轉(zhuǎn)化子，于30℃經(jīng)2％半乳糖誘導(dǎo)16h～32h實現(xiàn)了lacZ的高水平表達。

2、用酸洗玻璃珠法提取酵母蛋白，以X-gal為底物可方便地檢測lacZ表達產(chǎn)物的活性，經(jīng)改進在酶標板反應(yīng)孔中可對多個樣品的β-半乳糖苷酶活性進行快速檢測。
　　 2、構(gòu)建了PLRV-CP基因與PLRV缺失突變CP基因的釀酒酵母表達載體，并進行了基因表達的誘導(dǎo)。以pYES2.1/V5-His/-TOPO為起始載體，構(gòu)建了PLRV-CP基因(624bp)的酵母表達載體pYES-LRCP，工程菌株INVSc1(pYES-LRCP)經(jīng)半乳糖

3、誘導(dǎo)后，SDS-PAGE圖譜上沒有預(yù)期的表達蛋白。用PLRV缺失突變CP基因(498bp)的PCR產(chǎn)物與pYES2.1/V5-His/-TOPO連接構(gòu)建了突變基因的酵母表達載體pYES-LRCP-126，DNA測序結(jié)果確認了表達載體的正確性。在30℃，工程菌株INVSc1（pYES-LRCP-126）經(jīng)2％半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)16h，SDS-PAGE顯示蛋白圖譜上有一條23kDa的特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)期的重組CP相符。該表達蛋白呈水溶狀

4、態(tài)，但表達量較低。
　　 3、通過原核表達獲得了大量PLRV的重組CP。用本課題組構(gòu)建的PLRV缺失突變CP基因的原核表達載體pBAD-LRCP-126轉(zhuǎn)化受體大腸桿菌TOP10，工程菌株TOP10(pBAD-LRCP-126)經(jīng)0.2％阿拉伯糖誘導(dǎo)獲得了基因的高效表達，提取菌體總蛋白后經(jīng)鎳離子親和層析獲得了大量高純度的PLRV重組CP。
　　 4、制備了PLRV重組CP的特異性抗血清。用純化的重組CP作抗原免疫家兔獲得

5、了抗血清，間接ELISA定顯示效價可達1∶12800。
　　 5、獲得了重組CP的多克隆抗體(IgG)與酶標記抗體(IgG-AP)。先用飽和(NH4)2SO4
　　 進行鹽析，然后用ProteinG親和層析柱純化，獲得了高純度的抗體(IgG)。用戊二醛一步法對純化的抗體進行標記，獲得了IgG的堿性磷酸酶標記物(IgG-AP)。
　　 6、進行了PLRV的DAS-ELISA檢測。用制備的IgG與酶標抗體(IgG-A