馬立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物學(xué)活性的比較研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文馬立克氏病病毒野毒株GX0101及其基因敲除株BAC克隆生物學(xué)活性的比較研究姓名：孫愛軍申請學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：崔治中20090617馬立克氏病病毒野毒株G X 0 1 0 1 及其基因敲除株B A C 克隆生物學(xué)活性的比較研究 ．．2 ．1 k b 的同源臂來自質(zhì)粒p D S ．p H A I ，4 ．0 k b 同源臂來自質(zhì)粒p U S 2 - P a r t i a l —F ，通過限制

2、性內(nèi)切酶H i n d l I I 和X h oI 的雙酶切作用，及T 4 D N AL i g a t i o n 連接，成功構(gòu)建重組轉(zhuǎn)基因載體質(zhì)粒p D S - p H A I —U S 2 。2 ．2G X 0 1 0 1 B A C 感染性克隆的構(gòu)建及其拯救利用磷酸鈣或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將轉(zhuǎn)移載體p D S p H A I - U S 2 與M D VG X 0 1 0 1 感染C E F 細(xì)胞的總D N A 共感染雞胚成纖維細(xì)胞

3、。待出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將其傳至已加有霉酚酸．黃嘌呤．次黃嘌呤選擇培養(yǎng)基的原代C E F 上，經(jīng)四輪篩選、富集重組病毒后，提取重組病毒感染C E F 細(xì)胞的總D N A ，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌D H l 0 B 。次日，挑取陽性克隆。經(jīng)酶切及P C R鑒定后，提取B A C D N A 轉(zhuǎn)染C E F 細(xì)胞，再次啟動(dòng)了病毒感染，產(chǎn)生了M D V 特異性病毒蝕斑，拯救出了重組病毒；進(jìn)一步研究表明重組病毒b a c ．G X 0 1 0 1 與親本毒

4、G X 0 1 0 1 在體外C E F 單層上的生物學(xué)特性相似。2 ．3G X 0 1 0 1 感染性克隆的致病性比較將B A C 克隆毒b a e ．G X 0 1 0 1 與親本毒G X 0 1 0 1 接種1 日齡S P F 雞，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明b a e ．G X 0 1 0 1 毒株與親本G X 0 1 0 1 毒株對機(jī)體的生長性能等方面的影響沒有差異，而且b a e ．G X 0 1 0 1 毒株仍然保留著很好的免疫抑制功

5、能及致腫瘤能力。該感染性克隆b a c ．G X 0 1 0 1 為研究該重組野毒株中R E V - L T R 插入片段及其他基因的生物學(xué)功能提供了有用的技術(shù)平臺(tái)。3 敲除R E V - L T R 的感染性克隆的構(gòu)建及其生物學(xué)特性比較3 ．1M D V 天然重組野毒株G X 0 1 0 1 中L T R 序列的敲除M D V 和R E V 間的自然重組的機(jī)率是很低的，在我們近幾年分離到的十多個(gè)野毒株中，卻有兩個(gè)是重組病毒，說明這一重

6、組過程一定有某種選擇競爭性優(yōu)勢。為了闡明天然重組插入的R E V - L T R 究竟能給原始的M D V 帶來什么生物學(xué)特性變化，對基因組做相應(yīng)的突變是必經(jīng)的步驟。將G X 0 1 0 1 構(gòu)建成感染性細(xì)菌人工染色體，由于我們可以比較方便地對感染性克隆質(zhì)粒G X 0 1 0 1 ．B A C 基因組進(jìn)行修飾，如定點(diǎn)敲除重組野毒株中某個(gè)基因或基因片段。這就可以用其作為研究該株M D V 的特定基因或基因片段與致病性或其他生物學(xué)活性關(guān)系的

7、一個(gè)新的技術(shù)平臺(tái)。本研究利用R e d ／E T 介導(dǎo)的突變技術(shù)，用卡那霉素抗性基因代替要敲除的L T R 序列。設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒P K D l 3 為模板，擴(kuò)增卡那霉素抗性基因。這對引物3 ’端2 0 個(gè)堿基來源于卡那霉素抗性基因，用來擴(kuò)增該抗性基因，5 ’端5 0 個(gè)堿基來源于M D V ，用來同源重組，上下游引物5 ’端的這5 0 個(gè)堿基來源于M D V 基因組，分別位于要敲除的L T R 序列的兩端?？敲顾乜剐曰騼啥薋 R