馬立克氏病病毒CVI988弱毒疫苗株UL13基因的表達(dá)及其單克隆抗體的研制.pdf

1、馬立克氏病病毒(Marek's disease virus)的UL13基因與I型單純皰疹病毒(HSV-1)UL13基因和水痘．帶狀皰疹病毒(VZV)的ORF47基因同源，編碼一種被膜蛋白，分子量約57~60kDa?，F(xiàn)已證實(shí)，HSV-1 UL13和VZV ORF47具有蛋白激酶功能，能夠?qū)Χ喾N病毒蛋白和細(xì)胞蛋白進(jìn)行磷酸化修飾。 為了探討MDV UL13的生物學(xué)特性和功能，本研究在克隆UL13基因的基礎(chǔ)上通過分別構(gòu)建UL13重組桿狀

2、病毒和原核表達(dá)質(zhì)粒，成功獲得了在昆蟲細(xì)胞和大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)研制出抗UL13C末端原核表達(dá)產(chǎn)物的單克隆抗體，為進(jìn)一步探索MDV UL13發(fā)揮的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。 一、MDV UL13基因的克隆及序列分析 根據(jù)Genbank已發(fā)表的MDV GA株的序列，設(shè)計(jì)并合成一對ULl3特異引物，用PCR擴(kuò)增方法從MDV-1 CVl988株病毒感染的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)總DNA中擴(kuò)增出了ULl3基因，將該基因插入pGEM

3、T載體中進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得的序列與MDV-1其他毒株的UL13基因進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在MDV-1中高度保守，同源性達(dá)到了99.8％以上，僅在氨基酸192位GA株由Arg突變?yōu)镚in。用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫分析該序列發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的產(chǎn)物具有蛋白激酶的保守功能序列：在151 AGSGSYGVV159。中152、154、157位的G，159位的v與168 AVKK 171中的170位K共同參與結(jié)合ATP：在264 LTHLDIKCGNIFV

4、276序列中，268位D為質(zhì)子受體，參與質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，同時(shí)這段肽參與了與底物的結(jié)合，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶特征。MDV-1 ULl3基因與部分其他皰疹病毒科成員UL13基因及其同源物的同源性有9.1％～66.8％，但是各蛋白均含有真核細(xì)胞蛋白激酶的保守序列。上述分析提示MDV UL13基因也可能編碼一種蛋白激酶，并具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性。 二、MDV UL13基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其抗血清的研制 為了獲得抗MD

5、V UL13蛋白的抗體，本研究首先將UL13基因插入到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)進(jìn)行融合表達(dá)，經(jīng)過誘導(dǎo)證明全基因不能獲得表達(dá)。根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏嗜性，將UL13基因分段UL13C(115-513aa)，UL13N(1-114aa)，UL13S(260-400aa)和ULl3H(432-513aa)克隆，分別插入pGEX-6P-1載體中，與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶GST蛋白融合表達(dá)。經(jīng)過0.05mM IPTG

6、誘導(dǎo)5hr后，收獲細(xì)菌進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，并經(jīng)過Western blot驗(yàn)證，融合蛋白GST-UL13C,GST-UL13S和GST-UL13H獲得了表達(dá)，且主要以包涵體形式存在。將原核表達(dá)的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳分離，凝膠經(jīng)過染色脫色后，將目的蛋白條帶從凝膠中割出，用電洗脫的方式將ULll3原核表達(dá)產(chǎn)物回收，并經(jīng)SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證。將此電洗脫產(chǎn)物免疫小鼠，100μg/次，間隔2周，連續(xù)免疫4

7、次后．眶下竇靜脈采血分離血清。通過Western blot分析，結(jié)果該血清能與ULl3和GST原核表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，說明通過電洗脫純化的原核表達(dá)產(chǎn)物能夠有效的刺激小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該研究也為檢測UL13基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)提供了重要的生物材料。 三、MDV UL13基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及鑒定 將UL13基因從pGEM-UL13載體經(jīng)酶切，然后克隆到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pFastBacl TM中，將獲得的重組質(zhì)粒pFa

8、st-UL13轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)菌，在輔助質(zhì)粒的協(xié)助下發(fā)生轉(zhuǎn)座，通過藍(lán)白斑篩選挑取白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取重組Bacmid DNA，并通過PCR鑒定重組桿狀病毒rBacmid-UL13 DNA。將獲得重組桿狀病毒DNA通過脂質(zhì)體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞sf9，培養(yǎng)7d后收獲培養(yǎng)細(xì)胞和上清，并繼代培養(yǎng)2代。提取培養(yǎng)上清中桿狀病毒DNA，通過PCR方法鑒定重組桿狀病毒rBac-UL13。運(yùn)用研究二中制備的抗UL13蛋白的血清，通過間接IF

9、A和Western blot技術(shù)證明了MDV UL13蛋白在昆蟲細(xì)胞中獲得了表達(dá)，為研究重組蛋白的體外激酶活性分析打下基礎(chǔ)。 四、抗MDV UL13蛋白單克隆抗體的研制 通過雜交瘤技術(shù)，將免疫GST-UL13C原核表達(dá)產(chǎn)物小鼠(見研究二)的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)10天后，將收取的上清與感染rBacmid-UL13的sf9細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗(yàn)，通過有限稀釋法對陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行

10、亞克隆，最終獲得了4株能分泌抗UL13蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為MDV-UL13-4H9，MDV-UL13-4G11，MDV-UL13-5D12，MDV-UL13-2A4。通過IFA試驗(yàn)驗(yàn)證，這些單克隆抗體不與rBacmid-VP2(LBDV)，rBacmid-NP(AIV)感染的sf9細(xì)胞反應(yīng)，而與rBacmid—UL13感染的sf9細(xì)胞反應(yīng)，證明是抗MDV UL13的特異性單克隆抗體。抗UL13蛋白單抗的獲得為研究該蛋白