表達(dá)綠熒光蛋白的重組馬立克氏病病毒814株的構(gòu)建.pdf

1、雞馬立克氏病(Marek′s disease,MD)是由馬立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)引起的雞的一種高度傳染性、淋巴組織增生性疾病.MDV疫苗株是一種良好的病毒載體,以它作為載體構(gòu)建表達(dá)外源抗原的多價(jià)活疫苗來(lái)誘導(dǎo)免疫,可達(dá)到預(yù)防一種或多種禽病的目的. MDV血清Ⅰ型(MDV-1) 814株是我國(guó)分離到的自然弱毒株,長(zhǎng)期作為疫苗使用,免疫原性良好.選擇其作為病毒載體構(gòu)建重組病毒,可用于MD及其它禽病的

2、防治,同時(shí)也可利用其研究MDV基因功能及腫瘤發(fā)生機(jī)制. 本文利用MDV-1814疫苗株作為載體,以病毒基因組US10基因區(qū)為插入位點(diǎn),分別插入綠熒光蛋白 (green fluorescent protein,GFP) 基因表達(dá)盒、新城疫病毒 (Newcastle disease,virus,NDV)融合蛋白(Fusion,F)基因表達(dá)盒和禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)血凝素(Hemaggluti

3、nin,HA)基因表達(dá)盒,分別構(gòu)建了包含NDV F基因、AIV HA基因和GFP基因的重組MDV轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒,同時(shí)獲得了一株表達(dá)GFP的MDV 814株重組病毒. 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的MDV GA株US1-US10-SORF3基因序列,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,并于各引物5'端引入酶切位點(diǎn),以MDV 814株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物作為同源重組的MDV同源臂.同源臂1的上游引物在US1基因中部,下游引物在US10

4、基因上游,靠近起始密碼子;同源臂2的上游引物在US10基因下游,靠近終止密碼子,下游引物在SORF3基因中部.將兩PCR產(chǎn)物按照預(yù)先設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn),依次克隆入pUC19載體,構(gòu)建成重組MDV轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC-US10.經(jīng)過(guò)與GA株序列比較,證實(shí)獲得的MDV-1814株同源臂序列與預(yù)期相符合. 根據(jù)商品化表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1的序列,在其啟動(dòng)子上游及polyA下游分別設(shè)計(jì)一條引物,于引物5'端分別引入酶切位點(diǎn),以質(zhì)粒載體pEG

5、FP-N1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得GFP基因表達(dá)盒,其中包含CMV啟動(dòng)子和SV40 polyA.將此基因表達(dá)盒克隆入載體質(zhì)粒pUC-US10的Sph1位點(diǎn),獲得包含GFP基因表達(dá)盒的重組MDV轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒puC.USl0.GFP. 根據(jù)質(zhì)粒pEGFP-F (包含NDV F基因表達(dá)盒)和pCHA (包含AIV HA基岡表達(dá)盒)核苷酸序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物,PCR擴(kuò)增其中的NDV F和AIV HA基因表達(dá)盒部分,并克隆入質(zhì)粒pUC-

6、US10的Sph1位點(diǎn),獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pUC-US10-F和pUC-US10-HA. 采用磷酸鈣沉淀法,將MDV轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體puC-US10-GFP與MDV 814株基岡組總DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞 (chick embryo fibroblast,CEF),經(jīng)綠色熒光標(biāo)記篩選,獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的重組MDV 814病毒.PCR鑒定證實(shí)GFP基因表達(dá)盒正確插入到MDV-1 814株US10基因中.重組病毒在CEF上繼代

7、20代后,PCR鑒定可檢測(cè)到GFP基因,表明重組病毒能夠在體外穩(wěn)定遺傳.通過(guò)測(cè)定重組病毒和親本病毒的體外生長(zhǎng)曲線,證明重組病毒的生長(zhǎng)特性與親本病毒無(wú)顯著差異. 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白的重組MDV 814株,為我國(guó)MD疫苗的研究及MDV基因功能的研究奠定基礎(chǔ).同時(shí)還構(gòu)建了包含AIV HA基因和NDV F基因的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒,在此基礎(chǔ)上,可以通過(guò)反向篩選的方法獲得表達(dá)AIV HA蛋白和NDV F蛋白的重組814病毒.AI