部分菊花近緣種屬植物黑斑病苗期抗性及hrfA基因轉(zhuǎn)化菊花的研究.pdf

1、由鏈格孢屬（Alternaria）真菌侵染引起的黑斑病是菊花廣泛發(fā)生的重要葉部病害，在菊花栽培生產(chǎn)中，尤其是在溫濕度較高的溫室周年生產(chǎn)中、露地重茬連作條件下、腳芽夏插及夏季高溫多雨季節(jié)時(shí)，植株或插穗發(fā)病較重，有時(shí)甚至可導(dǎo)致菊花整株葉片全部萎爛褐死。因此，培育抗黑斑病菊花新品種是菊花抗病育種的重要目標(biāo)之一。然而，目前關(guān)于菊花黑斑病菌的研究還非常少，從部分菊花近緣種屬植物中篩選黑斑病抗源和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高菊花黑斑病抗性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本

2、研究以為利用菊花近緣種屬植物進(jìn)行栽培品種改良奠定前期工作基礎(chǔ)和創(chuàng)造菊花黑斑病抗病新種質(zhì)為目的，進(jìn)行了菊花黑斑病菌分離鑒定、部分菊花近緣種屬植物抗性鑒定評(píng)價(jià)、抗性相關(guān)葉片結(jié)構(gòu)特征和防御酶活性、抗病相關(guān)基因hrfA轉(zhuǎn)化菊花等研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.菊花黑斑病菌的分離鑒定及人工接種利用組織分離法和柯赫氏法則鑒定從菊花發(fā)病葉片中分離到6個(gè)致病菌株，通過(guò)PCA培養(yǎng)基上和自然寄主葉片上形態(tài)特征觀察發(fā)現(xiàn)：菌株A01、A03、A04

3、和A07的分生孢子與A02、A09的相比，其孢身中部的隔膜明顯較粗，呈黑褐色，主橫隔膜處縊縮也更為顯著；在自然寄主上，菌株A01、A02、A03、A04和A09的分生孢子一般單生或短鏈生（3～7個(gè)孢子），A02和A09的孢子鏈有側(cè)鏈分枝，菌株A07可形成罕分枝的超過(guò)10個(gè)孢子的分生孢子長(zhǎng)鏈；產(chǎn)孢表型觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)：菌株A01、A03、A04和A07可形成超過(guò)10個(gè)孢子的分生孢子長(zhǎng)鏈，且多數(shù)長(zhǎng)鏈不分枝，少數(shù)僅一次分枝且側(cè)鏈較短（1～5個(gè)孢子

4、）；菌株A02和A09的分生孢子鏈較短（少于10個(gè)分生孢子），主鏈不明顯，有多個(gè)側(cè)鏈，分枝豐富，支鏈一般1～5個(gè)孢子。據(jù)上述形態(tài)特征鑒定A01、A03、A04和A07為細(xì)極鏈格孢（A.tenuisimma），A02和A09為鏈格孢（A.alternata）。5.8SrDNA-ITS序列分析只能作為鏈格孢鑒定的輔助手段，可以將小孢子種與大孢子種區(qū)別開(kāi)，而不能區(qū)分一些遺傳差異較小的小孢子種。病菌離體接種試驗(yàn)結(jié)果表明6個(gè)菌株對(duì)菊花葉片的致病力

5、沒(méi)有差異；人工接種試驗(yàn)結(jié)果顯示不同菌株孢子混合懸浮液接種確保發(fā)病的孢子液濃度最低為1×106/ml，不同菌株菌絲混合液接種濃度為1×107/ml時(shí)植株發(fā)病癥狀十分明顯，是接種發(fā)病的合適濃度。
　　 2.部分菊花近緣種屬植物苗期黑斑病抗性鑒定、抗性相關(guān)葉片特性及防御酶活性研究對(duì)33份菊花近緣種屬植物苗期黑斑病抗性鑒定結(jié)果顯示，供試的大部分材料都表現(xiàn)出不同程度的感病性，病情指數(shù)從33.60到91.66不等；紫菀屬（Aster）的達(dá)摩

6、菊（A.spathulifolius）和亞菊屬（Ajania）的花磯菊（A.×marginatum）則表現(xiàn)為抗病，其病情指數(shù)分別為17.16和18.85；筑波磯菊（A.pacificum）、甘菊(D.lavandulifolium)、神農(nóng)架野菊[D.Indicum(Shennongjia)]和云南蓍（A.wilsoniana）表現(xiàn)為中抗，病情指數(shù)從25.62到28.85不等。
　　 對(duì)苗期抗病材料達(dá)摩菊和花磯菊，高感材料尖裂野菊

7、（D.indicum var.acutum）和貴州野菊[D.Indicum(Guizhou)]抗病相關(guān)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征分析發(fā)現(xiàn)，抗病材料葉片具有高而密的絨毛、高的蠟質(zhì)含量和柵欄組織/海綿組織比例?？共〔牧先~片正面絨毛密度為8.88 mm-2和17.84mm-2，背面為11.36 mm-2和37.98mm-2，高度分別為1.01mm和0.13mm，而感病材料葉片正面絨毛密度為0.28 mm-2和2.48 mm-2，背面為0.32 mm-2和4

8、.92 mm-2，高度為0.08和0.078mm;抗病材料葉片蠟質(zhì)含量分別為26.18和25.70,而感病材料僅為18.07和10.74。上述結(jié)果表明葉片表面絨毛的密度和高度、葉片蠟質(zhì)含量及柵欄組織與海綿組織的比例與菊花近緣種屬植物對(duì)黑斑病菌的抗性關(guān)系密切。
　　 對(duì)苗期抗黑斑病的達(dá)摩菊和花磯菊，高感黑斑病的尖裂野菊和貴州野菊葉片抗病相關(guān)防御酶活性研究結(jié)果顯示，黑斑病菌接種前抗病材料葉片苯丙氨酸解氨酶(PAL)、幾丁質(zhì)酶(CHT

9、)和β-1,3-葡聚糖酶(GLU)三種抗病相關(guān)防御酶的活性高于感病材料，接種后活性上升速度比感病材料快、幅度大且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。PAL和GLU活性在接種72h后達(dá)到峰值，而CHT活性在接種后96h達(dá)到峰值，接種后抗病材料三種酶的活性水平在不同接種時(shí)間點(diǎn)均顯著高于感病材料。說(shuō)明黑斑病菌接種前后菊花抗感近緣種屬植物葉片的PAL、CHT及GLU活性與抗性密切相關(guān)，可作為其苗期黑斑病抗性評(píng)價(jià)的生理指標(biāo)。
　　 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的hrfA基因轉(zhuǎn)

10、化菊花的研究對(duì)菊花品種‘碧玉臺(tái)’、‘奧運(yùn)火炬’、‘意大利紅’和‘神馬’在添加6-BA和NAA激素組合的MS培養(yǎng)基上的再生頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)基因型差異是決定菊花再生能力的關(guān)鍵因子，品種‘碧玉臺(tái)’具有高頻再生能力，是基因遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體系統(tǒng)，其葉片外植體再生合適的Km選擇壓力為15mg/L，生根選擇壓力為7.5mg/L;能夠完全抑制農(nóng)桿菌滋生并對(duì)外植體再生影響較小的Cb濃度為400mg/L;在此基礎(chǔ)上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了1

11、7株具Km抗性的hrfA基因轉(zhuǎn)化株；PCR、Southern雜交及RT-PCR分子檢測(cè)顯示hrfA基因在其中7個(gè)株系的染色體上整合并成功表達(dá)；采用葉片離體接種和活體植株接種法對(duì)7個(gè)轉(zhuǎn)基因菊花株系進(jìn)行了黑斑病抗性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因株系的抗性明顯提高；對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的表型特征觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)發(fā)育速度加快，開(kāi)花期提前；三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的結(jié)實(shí)率較野生型非轉(zhuǎn)化株嚴(yán)重下降，其中兩個(gè)株系的種子出苗率也明顯下降，表明hrfA基因