孕激素(DHP)調控魚類雌性性別分化過程的機制研究.pdf

1、魚類在脊椎動物系統(tǒng)演化過程中起著承前啟后的地位。因此，對魚類性別決定與分化機制的研究，是整個脊椎動物性別決定與分化的重要組成部分。與哺乳動物、鳥類等高等脊椎動物相比，魚類性別決定與分化機制具有原始性、易變性和多樣性。它仍然以遺傳基因為性別決定和分化的基礎，同時也會受到某些外界環(huán)境因素的影響，故魚類的性別決定與分化過程益顯復雜。孕激素（DHP）是包括尼羅羅非魚在類的大多數硬骨魚的配子成熟激素，它作為一種主要的性類固醇激素，僅在配子成熟時期

2、的體細胞中合成。主要是促進配子的最終成熟以及排精（卵）過程。通過離體和在體研究，已經證明了DHP信號通路在鱈魚(Gadus morhua)、大西洋鮭魚(Salmon salar)、日本鰻鱺(Anguilla japonica)等魚類的精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。但是到目前為止，DHP在硬骨魚類雌性性別分化過程中的作用還鮮為人知。因此，本實驗以尼羅羅非魚為實驗材料，通過CRISPR/Cas9技術敲除核受體pgr基因以及用孕激素受體拮抗劑R

3、U486阻斷DHP信號通路等實驗，深入研究DHP對雌性性別分化過程的調控機制，最終加深我們對DHP在尼羅羅非魚甚至硬骨魚類早期性別分化過程中的作用認識。本論文的主要研究結果如下：
　?。?）利用魚類孕激素（DHP）受體的拮抗劑RU486從孵化后5天（days after hatching。dah）開始處理基因型為 XX的雌性尼羅羅非魚，分別在20、40、90、120dah取材檢測。與正常的雌雄對照相比，RU486的持續(xù)處理不僅阻遏

4、了卵子發(fā)生過程，還降低性腺中雌性通路基因的表達和血清中雌激素水平。相反，RU486處理激活了雄性通路基因的表達。這暗示：魚類孕激素（DHP）直接或間接通過雌激素參與生殖細胞的減數分裂起始以及性別分化過程。
　?。?）運用RU486從5dah開始處理雌性尼羅羅非魚，分別到20、40、90dah停止處理，接著正常飼養(yǎng)到120dah取材檢測。令人驚奇的是，此時的性腺發(fā)育成具有生理功能的精巢。我們推測性逆轉的原因可能是由于體細胞的雄性化以

5、及內源性DHP的恢復所致。
　?。?）在用RU486阻斷DHP信號通路的同時，嘗試分別利用一定劑量的外源DHP/E2進行回救。額外補償DHP不能回救RU486對性腺發(fā)育的影響。同時發(fā)現(xiàn)，額外補償E2的性腺組織觀察結果顯示：E2能成功誘導RU486處理的雌魚恢復卵巢分化。不過有趣的是，在用RU486阻斷DHP這條信號通路時，E2不能完全的誘導雌性的發(fā)育。因為卵巢體細胞中foxl2和cyp19a1a的RNA表達水平仍然顯著性低于正常雌

6、魚對照。我們認為：在RU486處理魚中，外源E2誘導的卵子發(fā)生可能是直接作用于生殖細胞產生的結果，并不是通過內源性E2的產生這條途徑，當然具體的機制還需要進一步的研究。總的來說，在這些數據的基礎之上，我們提出“雌激素和孕激素（DHP）協(xié)同調控雌性發(fā)育”的觀點。
　?。?）利用CRISPR/Cas9技術成功在尼羅羅非魚建立孕激素核受體pgr的純合敲除體系。組織學檢測結果發(fā)現(xiàn)，在性別分化早期，純合敲除的雌雄魚與正常對照相比，無明顯差異