奶牛金黃色葡萄球菌黏附素基因的原核表達及其與牛白介素18的真核共表達和抗血清活性分析.pdf

1、奶牛乳腺炎是乳腺組織因病原微生物的感染而引起的炎癥，可導致奶牛生產(chǎn)性能低下，奶的產(chǎn)量和品質下降。嚴重者可造成患病乳區(qū)泌乳功能永久性喪失。在引發(fā)奶牛乳腺炎的病原菌中金黃色葡萄球菌的作用尤為突出，在某些地區(qū)大約50％以上的乳腺炎是由該菌引發(fā)。自發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌表面的黏附蛋白與其致病力密切相關后，黏附蛋白的相關研究一直是國內外研究的熱點。同時鑒于白細胞介素18(Interleukin-18，IL-18)具有多種生物學活性，在免疫調節(jié)、抗感染

2、及慢性炎癥性疾病發(fā)病過程中起著重要作用。所以我們針對金葡菌黏附素和牛白介素18展開了研究。 試驗1金黃色葡萄球菌ClfA功能基因的克隆表達 采用PCR方法對金黃色葡萄球菌山東分離株ZFB1的聚集因子A(ClfA)基因進行擴增，并將其克隆到原核表達載體pGEX-6p-1中獲得重組克隆pGEX/ClfA，使ClfA與GST進行融合表達。在SDS-PAGE和Western blot試驗中，表達產(chǎn)物分子量(約67KDa)同預期結

3、果相符，與兔源抗ZFB1全價血清有特異的抗體結合活性。本研究表明：金葡菌ZFB1的ClfA基因與已發(fā)表的NEWMAN株(NCBI ACCESSION NUMBER：AP009351)序列在核苷酸水平的同源性均為99.9％，氨基酸水平的同源性為100％，兩者的差異僅是由于在41位發(fā)生T變?yōu)镃的無義突變；在大腸桿菌中ClfA蛋白表達量可達菌體總蛋白的24.2％，從而為奶牛金黃色葡萄球菌性乳腺炎的防治提供了科學的實驗依據(jù)。 試驗2金黃

4、色葡萄球菌聚集因子ClfA蛋白抗血清活性分析 按照實驗1中最佳誘導條件誘導ClfA蛋白表達，而后進行SDS-PAGE，將其凍干并碾成粉末。用PBS與碾碎的粉末等體積混合后，取0.2ml(約20μg抗原)，腹腔和背部皮下注射健康的五周齡小鼠，每隔兩周加強免疫共五次，末次免疫后第10天斷尾采血制備血清，而后采用黏附與黏附抑制試驗模擬金黃色葡萄球菌定植奶牛乳腺組織的致病過程，以ClfA/GST抗血清的黏附抑制率表示其活性。結果顯示：2

5、％、1％、0.5％和0.2％的陽性血清其抑制率分別為65％、60％、46％和41％，與陰性血清相比差異極顯著(P<0.001)。隨著血清濃度的下降黏附抑制作用也減弱，當陽性血清濃度為0.1％時，黏附抑制作用則很不明顯，僅為3％，與陰性血清相比差異不顯著(P=0.35)。本研究結果證實ClfA可以作為保護性抗原基因，為研制有效的金黃色葡萄球菌性乳腺炎疫苗奠定了基礎。 試驗3金黃色葡萄球菌ClfA功能基因的克隆表達與牛IL-18基因

6、真核共表達載體的構建與表達 本研究旨在構建金黃色葡萄球菌聚集因子A基因和牛IL-18基因共表達的真核載體，并對其表達產(chǎn)物進行鑒定檢測。參照聚集因子A(ClfA)和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分別設計引物進行擴增，將ClfA基因和BoIL-18基因分別插入到真核雙表達載體pBUDCE4.1的CMV和EF-1α兩個啟動子的下游，構建攜帶兩個目的基因的重組真核雙表達載體pBUDCE/ClfA/BoIL-18。在Cellf

7、ectin Reagent的作用下轉染293T細胞，用間接免疫熒光試驗檢測ClfA和BoIL-18蛋白，結果證明重組質粒pBUDCE/ClfA/BoIL-18在293T細胞中同時表達了ClfA和BoIL-18蛋白。 該重組載體的成功構建為研究ClfA和BoIL-18重組共表達產(chǎn)物的生物學活性及其防治奶牛金黃色葡萄球菌性乳腺炎的作用奠定基礎。 試驗4金黃色葡萄球菌FnbpA功能基因的克隆表達與牛IL-18基因真核共表達載體

8、的構建與表達 本研究旨在構建金黃色葡萄球菌FnbpA基因和牛IL-18基因共表達的真核載體，并對其表達產(chǎn)物進行鑒定檢測。參照FnbpA和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分別設計引物進行擴增，將FnbpA基因和BoIL-18基因分別插入到真核雙表達載體pBUDCE4.1的CMV和EF-1α兩個啟動子的下游，構建攜帶兩個目的基因的重組真核雙表達載體pBUDCE/FnbpA/BoIL-18。在Cellfectin Reage