甘藍(lán)型油菜DH系群體構(gòu)建技術(shù)優(yōu)化研究.pdf

1、十字花科蕓薹屬作物油菜是世界四大油料作物之一，也是中國(guó)主要的油料作物之一。油菜具有適應(yīng)性強(qiáng)、用途廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、發(fā)展?jié)摿Υ蟮忍攸c(diǎn)。目前，現(xiàn)代生物技術(shù)，特別是單倍體培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，極大地促進(jìn)了優(yōu)質(zhì)油菜育種、高產(chǎn)育種與抗性育種的進(jìn)一步結(jié)合，不斷創(chuàng)新了一批又一批種質(zhì)資源，也不斷選育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交油菜品種。本研究是在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)大田自然環(huán)境下甘藍(lán)型油菜的小孢子培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化研究，建立出適合于大田環(huán)境的油菜DH系群體構(gòu)建技術(shù)體系。

2、 ⑴分批播種試驗(yàn)從8月28日開(kāi)始到11月16日結(jié)束，每10d一批，共九批次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：第三、四、五和第六期播種的材料才有利于產(chǎn)胚，以第四期播種的材料產(chǎn)胚總量最大，即在9月27日到10月7日之間播種材料更加有利于小孢子培養(yǎng)，研究的4個(gè)基因型材料中，第四期和第五期播種的材料產(chǎn)胚數(shù)占總產(chǎn)胚數(shù)的71.1％。 ⑵取樣時(shí)間研究表明：在蕾苔后期和初花期取花蕾培養(yǎng)有利于小孢子誘導(dǎo)胚狀體的產(chǎn)生，盛花期次之，蕾薹前期和終花期培養(yǎng)效果最差。產(chǎn)胚

3、情況因不同基因型材料有所不同。取單核晚期和雙核早期的小孢子才能產(chǎn)胚，這時(shí)多數(shù)花蕾長(zhǎng)度3.0～3.5mm，其次2.5～3.0mm的花蕾也有產(chǎn)胚的現(xiàn)象，小于2.5mm和大于4.0mm的花蕾很難產(chǎn)胚。 ⑶通過(guò)4℃低溫處理花蕾，12h內(nèi)都適合于小孢子培養(yǎng)，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到48h后，產(chǎn)胚很少或者基本不產(chǎn)胚，但以4℃低溫處理4h產(chǎn)胚率最高，其次是4℃低溫處理8h。通過(guò)4℃低溫處理花序，在24h內(nèi)都適合于小孢子培養(yǎng)。不同基因型材料之間，兩種處理

4、的產(chǎn)胚率差異不顯著；對(duì)于同一基因型材料而言，低溫處理花蕾的產(chǎn)胚率不如低溫處理花序的產(chǎn)胚率高。 ⑷選擇含有2.0％有效氯的NaC10消毒花蕾15～20min或者0.1％HgCl2消毒10min都能達(dá)到良好的消毒和培養(yǎng)效果。 ⑸游離小孢子提取分離時(shí)，B5液體培養(yǎng)基中蔗糖的濃度可以調(diào)整為2％；在胚狀體誘導(dǎo)苗的分化時(shí)，1.2％瓊脂+0.02％NAA+2.0mg/L6—BA+3.4mg/L hgNO3+3％蔗糖組合更加有利于胚的分

5、化和苗的形成。 ⑹子葉形或魚(yú)雷形胚狀體在1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d就分化出小植株，畸形胚在含有0.1mg/L的GA3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)30d后，部分基因型材料可以分化出少數(shù)苗，而不含有GA3培養(yǎng)基上培養(yǎng)的畸形胚，雖能發(fā)育成莖狀、芽狀或葉狀組織，但不能正常分化成苗，有的胚狀體逐漸變成褐色，最終死亡。 ⑺在1/2MS固體培養(yǎng)基中，用含2.0～3.0mg/L多效唑培養(yǎng)幼苗，可以在培養(yǎng)瓶中保存3個(gè)月左右，且植株生長(zhǎng)健壯，根系發(fā)育

6、良好，對(duì)于大田移栽沒(méi)有任何影響。 ⑻在生根培養(yǎng)基中加入0.5mg/L的IBA，有助于幼苗根系、生長(zhǎng)發(fā)育，根系粗壯，植株生長(zhǎng)健壯。但是，高濃度的IBA對(duì)植株發(fā)育有一定的抑制作用。 ⑼當(dāng)生根培養(yǎng)25d后，室內(nèi)煉苗10～15d，待苗完全成活后，陰天移栽到大田環(huán)境中，土壤的消毒和大田環(huán)境的良好管理有助于提高幼苗成活率。 ⑽通過(guò)小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)、胚狀體分化及幼苗的生根培養(yǎng)，ZB05共培養(yǎng)山240個(gè)單株，經(jīng)過(guò)煉苗移栽，最后獲得

7、191個(gè)單株，田間育性調(diào)查，共獲得112個(gè)正?？捎仓?。 ⑾用20對(duì)引物對(duì)隱性核不育系NAB-2及它的雙單倍體植株進(jìn)行了純度鑒定，篩選出18對(duì)引物具有多態(tài)性，共擴(kuò)增出32個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中有6對(duì)引物能將胚狀體苗和不育系姊妹交后代明顯區(qū)分開(kāi)來(lái)。20對(duì)引物中有11對(duì)引物都檢測(cè)出了胚狀體苗中的一株可育株。從胚狀體苗的純合性觀察，有6個(gè)單株在DNA水平上存在一定的多態(tài)性差異，其他單株之間純合性一致。在24個(gè)姊妹交后代植株中，沒(méi)有檢測(cè)出多