T-2毒素的自然發(fā)生與降解及其在對(duì)蝦中的蓄積規(guī)律.pdf

1、產(chǎn)T-2毒素鐮孢菌廣泛存在于自然環(huán)境中，并威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康。凡納濱對(duì)蝦為我國(guó)南方沿海城市湛江的主要養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一，考察T-2毒素在對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的發(fā)生情況及其在對(duì)蝦體內(nèi)的蓄積毒性不僅僅是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的迫切需求，更是保證食品安全的前提條件。本研究從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中分離得到27株鐮孢菌，選取一株鐮孢菌產(chǎn)毒培養(yǎng)后提取純化其代謝產(chǎn)物，用紅外光譜、核磁共振光譜分析，證明了其產(chǎn)物為T-2毒素，并且通過(guò)產(chǎn)毒菌株自主獲得的T-2毒素，為進(jìn)一步毒性實(shí)驗(yàn)

2、提供材料支持。研究表明對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在產(chǎn)T-2毒素鐮孢菌，給凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖帶來(lái)潛在危害，對(duì)T-2毒素的生物控制具有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)以對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的5株鐮孢菌產(chǎn)毒分離株為對(duì)象，考察其產(chǎn)毒培養(yǎng)過(guò)程中T-2毒素的變化，分離到2株T-2毒素降解菌，經(jīng)16SrRNA鑒定結(jié)果分別為彎曲假單胞菌和尼泊爾葡萄球菌，對(duì)T-2毒素的降解率分別為90.9％和85.5%，但兩者降毒能力并無(wú)顯著差異(P＞0.05)。其聯(lián)合作用也有較好降毒效果，與兩

3、菌株單獨(dú)作用無(wú)顯著差異(P＞0.05)，不同基質(zhì)對(duì)其聯(lián)合降毒作用影響不大(P＞0.05)。新的T-2毒素降解菌的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探明T-2毒素降解基因和開發(fā)T-2毒素生物降解酶提供了研究基礎(chǔ)。
　　建立高效液相色譜與多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)同步定量檢測(cè)對(duì)蝦血液、頭部、肌肉、外殼、肝胰腺和腸道中的T-2與 HT-2毒素方法。所建立方法通過(guò)選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、最低檢出限和最低定量限確證，結(jié)果顯示，樣本中內(nèi)源性物質(zhì)不干

4、擾目標(biāo)物的測(cè)定，選擇性良好；不同基質(zhì)條件下線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999；T-2毒素高中低濃度在不同部位的回收率在86.38%-112.49%之間，HT-2毒素的回收率在84.29%-106.23%之間，均滿足80%-120%的范圍內(nèi)；T-2的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.95%-9.03%間，HT-2的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.21%-10.11%間，不超過(guò)15%。本實(shí)驗(yàn)建立的方法靈敏度高選擇性好并且為國(guó)內(nèi)外首次建立的用LC-MS/MS檢測(cè)以對(duì)蝦不

5、同部位為基質(zhì)的T-2與HT-2毒素同步檢測(cè)方法。
　　采用探針劑量法測(cè)定、移動(dòng)平均法推算凡納濱對(duì)蝦的半數(shù)致死劑量(LD50值)。得到24h內(nèi)T-2毒素在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的半數(shù)致死劑量為30mg/kg BW。用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法找出急性染毒條件下對(duì)蝦各部位毒素分布與劑量和對(duì)蝦存活時(shí)間的關(guān)聯(lián)情況。結(jié)果顯示與染毒劑量關(guān)聯(lián)度從大到小前三位依次為頭部 T-2、肝胰腺 T-2和腸道 HT-2；與染毒對(duì)蝦存活時(shí)間關(guān)聯(lián)度由大到小排前三位的依次為腸道

6、 HT-2、肝胰腺T-2和肝胰腺HT-2。所以染毒劑量與對(duì)蝦免疫器官中毒素原形含量緊密相關(guān)，存活時(shí)間與對(duì)蝦消化器官中T-2毒素的代謝產(chǎn)物含量關(guān)系密切。
　　以3mg/kg BW T-2毒素對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉注射染毒，染毒后選取不同時(shí)間點(diǎn)取樣，用 LC-MS/MS方法定量檢測(cè)染毒蝦血液中目標(biāo)毒素濃度，用藥代動(dòng)力學(xué)軟件3p97分析處理數(shù)據(jù)，得到T-2毒素血液濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)符合權(quán)重為1/c2的三室模型，主要代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)為k12:0.00

7、 min-1；k21:9.66×10-2 min-1；k13:5.14×10-2 min-1；k31:1.41×10-3 min-1；k10:4.54×10-2 min-1；t1/2π:7.10 min；t1/2α:7.17 min；t1/2β:1.06×103 min；AUC:6.01×104 ng·min·g-1；CL(s):5.00×10-5 mg·（kg·min-1）-1·(ng·g-1)-1；Vc:1.10×10-3(mg·k

8、g-1)(ng·g-1)-1。檢測(cè)蝦體各部位毒素分布情況，得出毒素在對(duì)蝦體內(nèi)的分布規(guī)律。
　　按定期遞增量法進(jìn)行機(jī)體耐受性和蓄積性研究，通過(guò)蓄積系數(shù)K來(lái)評(píng)價(jià)蓄積作用強(qiáng)弱，并判斷對(duì)蝦在小劑量長(zhǎng)期染毒情況下是否出現(xiàn)對(duì)T-2毒素的耐受性。在上述研究基礎(chǔ)上設(shè)定染毒劑量組和方法，檢測(cè)目標(biāo)毒素在凡納濱對(duì)蝦血液、肌肉、肝胰腺、腸道、外殼中的蓄積量。按定期遞增劑量法染毒對(duì)蝦后分析其組織病理學(xué)變化情況。根據(jù)結(jié)果計(jì)算得到蓄積系數(shù)K=0.85＜1，表明

9、T-2毒素在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)高度蓄積。凡納濱對(duì)蝦對(duì)T-2毒素?zé)o明顯耐受。在口服T-2毒素劑量為0.5、1.5、4.5、13.5 mg/kg的染毒飼料20d后，用LC-MS/MS方法檢測(cè)血液、頭部、肌肉、外殼、肝胰腺和腸道中 T-2或 HT-2毒素，結(jié)果顯示均未檢出。定期遞增劑量法飼喂凡納濱對(duì)蝦后第八天腸道、肝胰腺和肌肉樣品病理切片顯示出現(xiàn)不同程度病變。表明T-2毒素在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)有功能蓄積，并可能以隱蔽態(tài)形式存在。本研究為T-2毒素在凡