凡納濱對蝦體內(nèi)隱蔽態(tài)T-2毒素的共性表征與危害識別.pdf

1、以T-2毒素暴露未出現(xiàn)物質(zhì)蓄積的染毒對蝦各組織勻漿液進行小鼠灌胃。分析小鼠的免疫功能指標(biāo)、血清生化指標(biāo)和遺傳毒性指標(biāo)的變化,根據(jù)總體概率學(xué)分析識別染毒對蝦對小鼠的損傷效應(yīng)。結(jié)果顯示,染毒對蝦對小鼠的免疫功能和遺傳特性產(chǎn)生明顯損害效應(yīng)(出現(xiàn)P<0.05的概率高),而小鼠的血清生化指標(biāo)未出現(xiàn)明顯變化(出現(xiàn)P<0.05的概率低),表明染毒對蝦具有免疫毒性和遺傳毒性,對小鼠造成的肝毒和腎毒損傷效應(yīng)較小。染毒對蝦自身沒有T-2毒素的物質(zhì)蓄積卻表現(xiàn)

2、出對小鼠免疫和遺傳上的功能蓄積毒性,說明了染毒對蝦中可能存在隱蔽態(tài)T-2毒素,可通過對蝦食物鏈,對小鼠產(chǎn)生損害效應(yīng)。
　　不同暴露劑量T-2毒素口服20d蓄積染毒對蝦經(jīng)有機溶劑提取,再采用三氟乙酸水解法處理,通過LC-MS/MS檢測處理前后樣品中T-2毒素含量,結(jié)果證實了對蝦體內(nèi)隱蔽態(tài)T-2毒素的存在;明確了對蝦中隱蔽態(tài)T-2毒素主要集中在對蝦的肝胰腺、血液、肌肉、蝦頭中,且隱蔽態(tài)T-2毒素解離率與對蝦的暴露劑量呈正相關(guān)。肝胰腺為

3、最主要的隱蔽態(tài)存在部位,在肝胰腺的上清樣中T-2毒素的增量為約為23.6 ng/尾,肝胰腺殘渣樣中解離出的T-2毒素增量約為為11.0 ng/尾。殘渣樣中隱蔽態(tài)T-2毒素被解離出,表明有機溶劑分離提取對蝦體內(nèi)的隱蔽態(tài)T-2毒素存在一定量的損失。
　　核磁共振和質(zhì)譜表征,證明了目標(biāo)T-2毒素母核半抗原3-Ac-NEOS的合成,利用紅細胞酶解法制備半抗原3-Ac-NEOS的方法可行且純度較高,半抗原的制備得到優(yōu)化,經(jīng)柱色譜分離純化后,

4、得到半抗原合成率為60％左右。在蒸氣浴條件下,3-Ac-NEOS與琥珀酸酐(HS)反應(yīng)合成了在C8位具有連接臂的3-Ac-NEOS-HS,后通過碳二亞胺法將半抗原與載體蛋白偶聯(lián)制備T-2毒素母核完全抗原,采用紫外掃描及SDS-PAGE凝膠電泳,最終確定了半抗原3-Ac-NEOS與蛋白的成功偶聯(lián),其中免疫原3-Ac-NEOS-HS-BSA內(nèi)3-Ac-NEOS與 BSA的偶聯(lián)比為8.76:1,包被原3-Ac-NEOS-HS-OVA內(nèi)3-Ac

5、-NEOS與OVA的偶聯(lián)比為7.24:1,兩個都在范圍(3～45):1之間,都具有免疫原性,且其中免疫原的偶聯(lián)比為8.76:1在范圍(8～25):1之間,表明能夠進行免疫產(chǎn)生具有較高效價的抗血清。
　　利用制備的T-2毒素母核完全抗原免疫新西蘭種兔子,經(jīng)間接ELISA法檢測,在第五次加強免疫后的抗血清,效價達到1:64000,可用于純化制備抗體。利用純化后的抗體建立間接競爭ELISA法分析抗體的靈敏度和特異性,結(jié)果顯示T-2毒素母

6、核抗體相對于具有母核結(jié)構(gòu)的A型單端孢霉烯族毒素特異性差,但相對于不具有母核結(jié)構(gòu)的B族毒素DON的特異性強,表明T-2毒素母核抗體可識別隱蔽態(tài)T-2毒素。間接競爭ELISA對T-2毒素的檢測限為49 ng/mL,IC50為0.228μg/mL。
　　同時利用包被抗原3-Ac-NEOS-HS-OVA偶聯(lián)羧基磁珠,制備了可識別T-2毒素母核抗體的3-Ac-NEOS-HS-OVA-免疫磁珠(T2-IMB),并以此磁珠建立間接競爭ELISA

7、,即免疫磁珠間接競爭ELISA(T2-IMB-ELISA)。T2-IMB-ELISA對T-2毒素母核的檢測限為0.023μmol/L,相當(dāng)于10.7 ng/mL的T-2毒素,檢測限明顯低于建立的常規(guī)間接競爭ELISA法49 ng/mL的檢測限;對T-2毒素加標(biāo)檢測的平均回收率為92.37%,且變異系數(shù)均在變異系數(shù)在3.26～6.43之間,說明T2-IMB-ELISA具有較高的回收率和檢測準(zhǔn)確性。T2-IMB-ELISA被成功應(yīng)用于檢測對