棉花果膠裂解酶基因(GhPEL)的功能研究及農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、大量棉纖維相關(guān)基因在棉纖維不同發(fā)育時期特異表達，控制著纖維的伸長和發(fā)育。單細胞結(jié)構(gòu)的棉纖維為研究纖維相關(guān)基因在纖維發(fā)育中的功能提供了一個良好的實驗系統(tǒng)。棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為棉花目標性狀的遺傳改良和重要基因的功能驗證奠定了基礎(chǔ)。
　　 本實驗利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，研究棉花果膠鹽裂解酶(Pectate lyase，PEL)基因GhPEL在棉纖維發(fā)育中的功能。Gh PEL是棉纖維特異表達的基因，在根、莖、葉、

2、胚珠中都微弱表達，主要在開花后5-15天(DPA)的纖維中表達，在10 DPA的纖維中表達量最高。通過原核表達技術(shù)，從大腸桿菌中純化到預(yù)期大小的棉花果膠裂解酶蛋白，酶活性測定發(fā)現(xiàn)其具有典型的果膠裂解酶活性。為進一步研究該基因的功能，用pBI121質(zhì)粒載體構(gòu)建了E6棉纖維?；磉_啟動子驅(qū)動的反義表達載體(E6ASP)；并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將E6ASP導(dǎo)入棉花W0品系，通過棉花體細胞胚胎發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株。對每個再生單株都進行

3、NPTII和啟動子-基因特異的PCR檢測，經(jīng)過連續(xù)兩個世代的選擇，獲得了11個轉(zhuǎn)基因株系。這些GhPEL的反義轉(zhuǎn)基因株系大多都表現(xiàn)出纖維顯著變短的表型，而纖維的強度和細度變化不大。選取其中六個轉(zhuǎn)基因純合株系進一步分析GhPEL基因在纖維發(fā)育中的功能。Southern雜交分析表明，這六個轉(zhuǎn)基因株系都只含一個或兩個拷貝；定量RT-PCR和酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，GhPEL在六個轉(zhuǎn)基因株系10-15 DPA纖維中的表達都受到了顯著抑制、酶活性顯著降低

4、；通過測定棉纖維細胞壁中果膠裂解酶的底物去酯化果膠的含量發(fā)現(xiàn)，去酯化果膠在轉(zhuǎn)基因株系的棉纖維中都有顯著的積累；這些轉(zhuǎn)基因株系都表現(xiàn)出了纖維不同程度變短的表型.這些結(jié)果表明，GhPEL基因在棉纖維伸長期的抑制表達使PEL酶活性降低，影響了纖維細胞壁中去酯化果膠的降解，導(dǎo)致纖維伸長時細胞壁松弛受阻，從而抑制了棉纖維的伸長。
　　 Gh PEL基因在花粉四分體時期特異表達。用pBI121質(zhì)粒載體構(gòu)建了GhPEL的CaMV35S組成性表

5、達啟動子驅(qū)動的過量表達載體(35SP)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這個表達載體轉(zhuǎn)入棉花W0品系.T0代轉(zhuǎn)基因植株花粉的形態(tài)和活力都發(fā)生了變異，這可能由于35S啟動子驅(qū)動GhPEL基因在花粉不同發(fā)育時期過量表達，干擾了PEL在花粉中的正常功能，從而使花粉發(fā)育受阻。此外，在進行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化中，發(fā)現(xiàn)并培育了兩個性狀可穩(wěn)定遺傳的突變體株系：一個單拷貝插入的卷葉突變體株系和一個單拷貝插入的矮桿突變體株系，并對其進行了初步分析。這些突變體株系的獲得，為棉花

6、形態(tài)發(fā)育的分子生物學(xué)機理研究提供了寶貴的實驗材料。
　　 此外，用帶pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌株轉(zhuǎn)化泗棉3號胚性愈傷組織，建立了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系，大大提高了轉(zhuǎn)化效率。在對獲得的再生植株進行GUS和NPTII基因的PCR跟蹤檢測，共得到97株陽性轉(zhuǎn)基因植株。GUS組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，97株轉(zhuǎn)基因幼苗中有10株GUS檢測陰性，嫁接后只成活一株。利用來源于同一愈傷系的GUS檢測陽性植株作為對照，對這

7、一GUS檢測陰性的植株進行GUS基因沉默機理研究。Southern分析表明，該GUS檢測陰性植株與GUS檢測陽性植株有相同拷貝數(shù)；GUS組織化學(xué)檢測和RT-PCR分析顯示，GUS基因在GUS檢測陰性植株中沒有表達，而NPTII基因在這兩株轉(zhuǎn)基因棉花中都表達；用限制性內(nèi)切酶-PCR法分析35S啟動子區(qū)甲基化發(fā)現(xiàn)：GUS檢測陰性植株35S啟動子區(qū)TATA box的HapII/MspI酶切位點發(fā)生甲基化，而GUS檢測陽性植株該位點沒有甲基化。