棉花果膠裂解酶基因(GhPEL)的功能研究及農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花胚性愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、大量棉纖維相關(guān)基因在棉纖維不同發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)，控制著纖維的伸長(zhǎng)和發(fā)育。單細(xì)胞結(jié)構(gòu)的棉纖維為研究纖維相關(guān)基因在纖維發(fā)育中的功能提供了一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立為棉花目標(biāo)性狀的遺傳改良和重要基因的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，研究棉花果膠鹽裂解酶(Pectate lyase，PEL)基因GhPEL在棉纖維發(fā)育中的功能。Gh PEL是棉纖維特異表達(dá)的基因，在根、莖、葉、

2、胚珠中都微弱表達(dá)，主要在開(kāi)花后5-15天(DPA)的纖維中表達(dá)，在10 DPA的纖維中表達(dá)量最高。通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)，從大腸桿菌中純化到預(yù)期大小的棉花果膠裂解酶蛋白，酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)其具有典型的果膠裂解酶活性。為進(jìn)一步研究該基因的功能，用pBI121質(zhì)粒載體構(gòu)建了E6棉纖維專化表達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反義表達(dá)載體(E6ASP)；并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將E6ASP導(dǎo)入棉花W0品系，通過(guò)棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)每個(gè)再生單株都進(jìn)行

3、NPTII和啟動(dòng)子-基因特異的PCR檢測(cè)，經(jīng)過(guò)連續(xù)兩個(gè)世代的選擇，獲得了11個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。這些GhPEL的反義轉(zhuǎn)基因株系大多都表現(xiàn)出纖維顯著變短的表型，而纖維的強(qiáng)度和細(xì)度變化不大。選取其中六個(gè)轉(zhuǎn)基因純合株系進(jìn)一步分析GhPEL基因在纖維發(fā)育中的功能。Southern雜交分析表明，這六個(gè)轉(zhuǎn)基因株系都只含一個(gè)或兩個(gè)拷貝；定量RT-PCR和酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GhPEL在六個(gè)轉(zhuǎn)基因株系10-15 DPA纖維中的表達(dá)都受到了顯著抑制、酶活性顯著降低

4、；通過(guò)測(cè)定棉纖維細(xì)胞壁中果膠裂解酶的底物去酯化果膠的含量發(fā)現(xiàn)，去酯化果膠在轉(zhuǎn)基因株系的棉纖維中都有顯著的積累；這些轉(zhuǎn)基因株系都表現(xiàn)出了纖維不同程度變短的表型.這些結(jié)果表明，GhPEL基因在棉纖維伸長(zhǎng)期的抑制表達(dá)使PEL酶活性降低，影響了纖維細(xì)胞壁中去酯化果膠的降解，導(dǎo)致纖維伸長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞壁松弛受阻，從而抑制了棉纖維的伸長(zhǎng)。
　　 Gh PEL基因在花粉四分體時(shí)期特異表達(dá)。用pBI121質(zhì)粒載體構(gòu)建了GhPEL的CaMV35S組成性表

5、達(dá)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的過(guò)量表達(dá)載體(35SP)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花W0品系.T0代轉(zhuǎn)基因植株花粉的形態(tài)和活力都發(fā)生了變異，這可能由于35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GhPEL基因在花粉不同發(fā)育時(shí)期過(guò)量表達(dá)，干擾了PEL在花粉中的正常功能，從而使花粉發(fā)育受阻。此外，在進(jìn)行棉花的遺傳轉(zhuǎn)化中，發(fā)現(xiàn)并培育了兩個(gè)性狀可穩(wěn)定遺傳的突變體株系：一個(gè)單拷貝插入的卷葉突變體株系和一個(gè)單拷貝插入的矮桿突變體株系，并對(duì)其進(jìn)行了初步分析。這些突變體株系的獲得，為棉花

6、形態(tài)發(fā)育的分子生物學(xué)機(jī)理研究提供了寶貴的實(shí)驗(yàn)材料。
　　 此外，用帶pBI121質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404菌株轉(zhuǎn)化泗棉3號(hào)胚性愈傷組織，建立了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化棉花胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系，大大提高了轉(zhuǎn)化效率。在對(duì)獲得的再生植株進(jìn)行GUS和NPTII基因的PCR跟蹤檢測(cè)，共得到97株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。GUS組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，97株轉(zhuǎn)基因幼苗中有10株GUS檢測(cè)陰性，嫁接后只成活一株。利用來(lái)源于同一愈傷系的GUS檢測(cè)陽(yáng)性植株作為對(duì)照，對(duì)這

7、一GUS檢測(cè)陰性的植株進(jìn)行GUS基因沉默機(jī)理研究。Southern分析表明，該GUS檢測(cè)陰性植株與GUS檢測(cè)陽(yáng)性植株有相同拷貝數(shù)；GUS組織化學(xué)檢測(cè)和RT-PCR分析顯示，GUS基因在GUS檢測(cè)陰性植株中沒(méi)有表達(dá)，而NPTII基因在這兩株轉(zhuǎn)基因棉花中都表達(dá)；用限制性內(nèi)切酶-PCR法分析35S啟動(dòng)子區(qū)甲基化發(fā)現(xiàn)：GUS檢測(cè)陰性植株35S啟動(dòng)子區(qū)TATA box的HapII/MspI酶切位點(diǎn)發(fā)生甲基化，而GUS檢測(cè)陽(yáng)性植株該位點(diǎn)沒(méi)有甲基化。