核衣殼靶向滅活策略篩選抗豬2型圓環(huán)病毒基因的初步研究.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（porcine circovirus type 2，PCV2）是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的原發(fā)病原，并與豬皮炎腎病綜合征（PNDS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、增生性壞死性肺炎(PNP)、新生仔豬先天性震顫（CT-AII）等的發(fā)生密切相關(guān)，這些疾病被統(tǒng)稱為豬2型圓環(huán)病毒病。豬2型圓環(huán)病毒病已成為嚴重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要的

2、免疫抑制性疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　 面對PCV2給養(yǎng)豬業(yè)造成的重大損失，目前市場上卻沒有相應的有效疫苗和藥物。因而探索抗豬2型圓環(huán)病毒感染的新策略成為當今研究的熱點。衣殼蛋白靶向滅活(capsid targeted viral inactivation，CTVI)策略是近年來新興的基于蛋白水平的抗病毒策略，與其他基于核酸水平的抗病毒策略（如RNAi，反義核酸，核酶等）相比具有穩(wěn)定、特異、高效、可有效避免因突變引

3、起的免疫逃逸等優(yōu)點。CTVI策略的出現(xiàn)為抗豬2型圓環(huán)病毒感染提供了新的思路。
　　 本研究主要探索了CTVI策略應用于抗豬2型圓環(huán)病毒感染的可行性，構(gòu)建了衣殼蛋白靶向核酸酶融合基因結(jié)構(gòu)，并對基因結(jié)構(gòu)的抗病毒效果進行了檢測。
　　 從金黃色葡萄球菌中直接擴增獲得了金黃色葡萄球菌核酸酶的編碼序列，通過拼裝獲得了將該核酸酶置于PCV2核衣殼蛋白氨基端（JNPC）和羧基端(PNJC)的兩種融合蛋白基因。以pET-20b（+）原核

4、表達載體為骨架對融合基因進行原核表達，并對表達產(chǎn)物生物學活性進行了分析。結(jié)果表明構(gòu)建的兩個融合蛋白基因表達的蛋白分子量大小約47KD，與預期大小相一致。使用特異性抗體進行Western Blot分析顯示蛋白產(chǎn)物為融合目的蛋白。表達產(chǎn)物具有降解核酸的核酸酶活性，能夠?qū)NA進行切割。這些結(jié)果為進一步探討豬2型圓環(huán)病毒衣殼蛋白靶向抗PCV2感染作用的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 以pIRESneo載體為骨架構(gòu)建了JNPC、PNJC、Cap

5、基因真核表達載體，通過細胞轉(zhuǎn)染和G418篩選獲得了穩(wěn)定表達上述三個基因以及攜帶pIRESneo載體的細胞系。采用PCR，RT-PCR，Northern Blot、Western Blot、DNA消化實驗對轉(zhuǎn)基因細胞系和蛋白表達產(chǎn)物進行鑒定與檢測。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞系中有外源基因整合，融合基因在mRNA水平表達水平較低，經(jīng)驗證主要由融合基因存在異常拼接所致，細胞中有融合蛋白表達，且融合蛋白產(chǎn)物具有良好的核酸酶活性。
　　 上述四個

6、轉(zhuǎn)基因細胞系及未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的細胞進行病毒傳代實驗，通過半定量PCR和熒光定量PCR檢測各細胞系中PCV2基因組含量，分析抗病毒效果。結(jié)果表明，病毒傳遞10代后，兩種檢測方法中，JNPC轉(zhuǎn)基因細胞系病毒滴度與對照組相比分別下降了約60.55％和53.46％，而其他組間病毒滴度非常接近。兩種方法結(jié)果基本相符，說明了所得數(shù)據(jù)的準確性。這一結(jié)果證明了CTVI策略適用于PCV2的抗病毒基因的篩選，獲得了具有一定抗病毒效果的基因結(jié)構(gòu)JNPC。但與已有