核衣殼靶向滅活策略篩選抗豬2型圓環(huán)病毒基因的初步研究.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（porcine circovirus type 2，PCV2）是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的原發(fā)病原，并與豬皮炎腎病綜合征（PNDS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、增生性壞死性肺炎(PNP)、新生仔豬先天性震顫（CT-AII）等的發(fā)生密切相關(guān)，這些疾病被統(tǒng)稱(chēng)為豬2型圓環(huán)病毒病。豬2型圓環(huán)病毒病已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要的

2、免疫抑制性疫病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 面對(duì)PCV2給養(yǎng)豬業(yè)造成的重大損失，目前市場(chǎng)上卻沒(méi)有相應(yīng)的有效疫苗和藥物。因而探索抗豬2型圓環(huán)病毒感染的新策略成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。衣殼蛋白靶向滅活(capsid targeted viral inactivation，CTVI)策略是近年來(lái)新興的基于蛋白水平的抗病毒策略，與其他基于核酸水平的抗病毒策略（如RNAi，反義核酸，核酶等）相比具有穩(wěn)定、特異、高效、可有效避免因突變引

3、起的免疫逃逸等優(yōu)點(diǎn)。CTVI策略的出現(xiàn)為抗豬2型圓環(huán)病毒感染提供了新的思路。
　　 本研究主要探索了CTVI策略應(yīng)用于抗豬2型圓環(huán)病毒感染的可行性，構(gòu)建了衣殼蛋白靶向核酸酶融合基因結(jié)構(gòu)，并對(duì)基因結(jié)構(gòu)的抗病毒效果進(jìn)行了檢測(cè)。
　　 從金黃色葡萄球菌中直接擴(kuò)增獲得了金黃色葡萄球菌核酸酶的編碼序列，通過(guò)拼裝獲得了將該核酸酶置于PCV2核衣殼蛋白氨基端（JNPC）和羧基端(PNJC)的兩種融合蛋白基因。以pET-20b（+）原核

4、表達(dá)載體為骨架對(duì)融合基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明構(gòu)建的兩個(gè)融合蛋白基因表達(dá)的蛋白分子量大小約47KD，與預(yù)期大小相一致。使用特異性抗體進(jìn)行Western Blot分析顯示蛋白產(chǎn)物為融合目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物具有降解核酸的核酸酶活性，能夠?qū)NA進(jìn)行切割。這些結(jié)果為進(jìn)一步探討豬2型圓環(huán)病毒衣殼蛋白靶向抗PCV2感染作用的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 以pIRESneo載體為骨架構(gòu)建了JNPC、PNJC、Cap

5、基因真核表達(dá)載體，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和G418篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)上述三個(gè)基因以及攜帶pIRESneo載體的細(xì)胞系。采用PCR，RT-PCR，Northern Blot、Western Blot、DNA消化實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定與檢測(cè)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中有外源基因整合，融合基因在mRNA水平表達(dá)水平較低，經(jīng)驗(yàn)證主要由融合基因存在異常拼接所致，細(xì)胞中有融合蛋白表達(dá)，且融合蛋白產(chǎn)物具有良好的核酸酶活性。
　　 上述四個(gè)

6、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及未經(jīng)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞進(jìn)行病毒傳代實(shí)驗(yàn)，通過(guò)半定量PCR和熒光定量PCR檢測(cè)各細(xì)胞系中PCV2基因組含量，分析抗病毒效果。結(jié)果表明，病毒傳遞10代后，兩種檢測(cè)方法中，JNPC轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系病毒滴度與對(duì)照組相比分別下降了約60.55％和53.46％，而其他組間病毒滴度非常接近。兩種方法結(jié)果基本相符，說(shuō)明了所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。這一結(jié)果證明了CTVI策略適用于PCV2的抗病毒基因的篩選，獲得了具有一定抗病毒效果的基因結(jié)構(gòu)JNPC。但與已有