假型豬溫病毒體系構(gòu)建及衣殼蛋白靶向滅活策略抗豬瘟病毒感染研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文假型豬溫病毒體系構(gòu)建及衣殼蛋白靶向滅活策略抗豬瘟病毒感染研究姓名：周斌申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物技術(shù)指導(dǎo)教師：陳溥言201006假型豬瘟病毒體系構(gòu)建及農(nóng)殼蛋白靶向滅活策略抗豬瘟病毒感染研究核表達(dá)載體pcDNA30，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAE0，pcDNAE2和pcDNAE012將此3個(gè)質(zhì)粒經(jīng)大量提取并純化后，經(jīng)磷酸鈣轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(293T)采用兔抗豬瘟高免血清為一抗，F(xiàn)ITCSPA為二抗，分別應(yīng)用流式

2、細(xì)胞術(shù)(FACS)和免疫轉(zhuǎn)印(Westernblot)鑒定真核質(zhì)粒在293T細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明3個(gè)質(zhì)粒均可在293T細(xì)胞中表達(dá)，Westernblot檢測分析到了257、415弄P90kDa的3個(gè)條帶，F(xiàn)ACS檢測到熒光細(xì)胞比例分別為602％、552％和565％說明囊膜糖蛋白EO、E2和E012均能表達(dá)在細(xì)胞膜上，為后續(xù)假病毒顆粒的形成奠定了基礎(chǔ)2構(gòu)建整合囊膜糖蛋白的假型豬瘟病毒體系及其鑒定將上述已經(jīng)鑒定的重組真核表達(dá)質(zhì)瘩3pcDN

3、AE0，pcDNAE2和pcDNAE012分別與MuLv49型病毒構(gòu)建體系的兩種骨架載體pHIT60(括MuLV的結(jié)構(gòu)蛋白基因，屠Pgag和p01)和pHITlll(為MuLv的基因組，還包括一個(gè)報(bào)告基因腸c西經(jīng)磷酸鈣瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集假病毒上清，超速離心后純化假病毒顆粒用抗CSFV的多抗為一抗，通過Westernblot證明了整個(gè)囊膜糖蛋白E012能夠在假病毒顆粒表面表達(dá)，說明E012能夠整合至1]MuLv病毒粒子表

4、面，該假型豬瘟病毒感染SK6、PK15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8種細(xì)胞，48h后檢測發(fā)現(xiàn)只有在豬源細(xì)胞SK6、PK15和STtt，標(biāo)記基因三口cz能有效表達(dá)，表明所構(gòu)建的假病毒具有感染性，但只能夠感染豬源細(xì)胞因此通過該假型豬瘟病毒進(jìn)一步證實(shí)了豬瘟病毒對豬的單一嗜性另外，純化后的病毒經(jīng)ReedMuench計(jì)算其TCID50為10458。加入各種濃度的NH4CI(030mmoVL)預(yù)先處理PK15細(xì)胞，37

5、“Cig育1h，而后加AMuLVE012作用，48l詬，拗JLacZ表達(dá)量；同時(shí)i殳pH依賴性的MuLVVSVG為陽性對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MuLⅣE012感染性與NH4Cl濃度存在極顯著的線性負(fù)相關(guān)性，即隨著pH值的升高，假型病毒MuLVE012對PK15細(xì)胞感染能力逐漸降低，而當(dāng)NH4CI濃度達(dá)至130mmol／L時(shí)MuLVE012進(jìn)入宿主細(xì)胞幾乎被完全抑制因此通過假型豬瘟病毒證實(shí)了豬瘟病毒侵入細(xì)胞是受NpH影響的，即是pH值依賴型囊膜病

6、毒為避免操作活的病毒帶來的搞危險(xiǎn)性，本研究利用假型豬瘟病毒建立了微量中和試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陰PEl生血清和倍比稀釋的待檢血清56℃滅活30lIlin后，對每份血清進(jìn)行2倍梯度稀釋，分別與假病毒MuLⅣE012按1：1混合，4℃過夜分別取100ItL上述病毒血清混合物一式3份加到96孔板PKl5細(xì)胞中，建立了微量中和試驗(yàn)，與全病毒微量中和試驗(yàn)進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所建立的方法能夠代替全病毒進(jìn)行血清中和抗體滴度的測定，能夠檢測臨床血清的豬瘟抗體中和