西伯利亞鱘源嗜水氣單胞菌致病菌分離鑒定、免疫特性及全菌苗研究.pdf

1、西伯利亞鱘（Acipenserbaerii）自1996年被引進中國以來，其養(yǎng)殖量已居我國鱘養(yǎng)殖產(chǎn)量第2位。近年來，病害頻頻發(fā)生已成為西伯利亞鱘養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。我國養(yǎng)殖鱘疾病以細菌病為主，傳統(tǒng)藥物防治容易污染水質(zhì)，易造成藥物殘留等現(xiàn)象，藥物的長期使用還可造成病原菌產(chǎn)生耐藥性，最終對疾病的防治造成了困難。探索有效的生物防治方法將是預(yù)防疾病發(fā)生的趨勢，免疫防治技術(shù)在防治鱘病中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，我國關(guān)于西伯利亞鱘細菌病病原報道較

2、少，而有關(guān)細菌病疫苗防治尚未見報道。因此，有關(guān)西伯利亞鱘細菌病病原菌分離鑒定及疫苗研究等理論基礎(chǔ)研究顯得尤為重要。 本實驗論文共分三個部分。第一部分：西伯利亞鱘源細菌性敗血癥致病菌株X1分離鑒定；第二部分：致病菌X1全菌疫苗制備及免疫效果研究；第三部分：致病菌株X1與同屬菌株免疫交叉反應(yīng)比較；第四部分：致病菌X1與同屬菌株外膜蛋白免疫特性分析。具體內(nèi)容如下： 第一部分：本實驗從患細菌性敗血癥的西伯利亞鱘（Acipense

3、rbaerii）的體內(nèi)分離到一株致病菌株X1，其對西伯利亞鱘的半數(shù)致死濃度（LC50）為5.5×105cfu/mL，具有較強毒力；菌株X1為革蘭氏陰性桿菌，菌體大小為1.0μm～1.2μm×2.1μm～2.4μm，周生側(cè)鞭毛，在兔血瓊脂平板上能形成明顯的β-溶血圈，經(jīng)ATB細菌鑒定儀鑒定和16SrDNA序列分析，菌株X1為嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophila）（登錄號：EU669667）；其系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株X1與嗜

4、水氣單胞菌ATCC35654（登錄號：X74676.1）的親緣關(guān)系最近，其同源性為99％。此外，菌株X1對先鋒必、左氟沙星等2種藥物高度敏感，對妥布霉素、氟哌酸、舒普深、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)達欣、萬古霉素、新霉素、多粘菌素B、洛美沙星等10種藥物中度敏感。目前，國內(nèi)尚無關(guān)于西伯利亞鱘細菌性病害分離鑒定的相關(guān)報道。本實驗分離得X1菌株是國內(nèi)具有周生側(cè)鞭毛的鱘源嗜水氣單胞菌的首次報道。 第二部分：將分離得到X1菌株用0.20％福爾

5、馬林滅活，將菌株X1制成滅活全菌苗，對西伯利亞鱘進行注射免疫。在加強免疫后35d，全菌苗組西伯利亞鱘血清抗體凝集效價達到最大值，為4.77±0.70，較對照組西伯利亞鱘血清抗體凝集效價高42.5％（P<0.05）。全菌苗組免疫球蛋白含量達到最大值，為（5.48±0.50）g/L，較對照組西伯利亞鱘血清免疫球蛋白含量高36％（P<0.05）。在加強免疫后7d，全菌苗組西伯利亞鱘血清溶菌酶含量達到最大值，為（171.1±5.9）U/ml，較

6、對照組西伯利亞鱘血清溶菌酶含量高44.4％（P<0.05）。全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，有利于進一步提高西伯利亞鱘血清抗體水平、免疫球蛋白以及溶菌酶含量。嗜水氣單胞菌X1全菌苗對西伯利亞鱘抗嗜水氣單胞菌X1人工感染也具有較好的免疫保護作用，其對西伯利亞鱘的免疫保護率為50％，而且在全菌苗中加入弗氏不完全佐劑，其對西伯利亞鱘抗嗜水氣單胞菌X1人工感染的免疫保護作用更好，其對西伯利亞鱘的免疫保護率為70％。 傳統(tǒng)的疫苗多是一種疫苗針

7、對一種抗原，氣單胞菌的變異性較大，血清型較多，傳統(tǒng)疫苗不能在實際生產(chǎn)過程中發(fā)揮理想的預(yù)防疾病作用。而亞單位疫苗的研究和發(fā)展為一種疫苗針對一種抗原的多個亞型或血清型，甚至多種抗原提供了可能性。外膜蛋白（outermembraneprotein，OMP）被證明是一種保護性抗原，具有良好的免疫原性，很容易被宿主的免疫防御體系識別為異物。在對宿主的感染和免疫中扮演著重要的角色，是重要的保護性抗原。 第三部分：本實驗制備了鱘細菌敗血癥致病

8、菌嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophlia）X1菌株與致病性豚鼠氣單胞菌（Aeromonascaviae）XL2-T菌株與致病性溫和氣單胞菌（AeromonasSobria）W1菌株及無致病性嗜水氣單胞菌（Aeromonashydrophlia）M3菌株4株菌株抗血清，并通過間接熒光免疫抗體技術(shù)檢測4株菌株之間免疫交叉反應(yīng)。熒光免疫結(jié)果顯示具有致病性的同屬菌株X1菌株、XL-2-T菌株、W1菌株存在較強免疫交叉反應(yīng)。無致病性

9、菌株M3與其他3株致病性菌株免疫交叉反應(yīng)較弱。 第四部分：利用十二烷基肌氨酸鈉（Sarkosyl）抽提結(jié)合超速離心純化方法分離提取了上述四株氣單胞菌的主要外膜蛋白，通過SDS-PAGE分析其外膜蛋白組成結(jié)構(gòu)，將菌株X1的主要外膜蛋白其他3株氣單胞菌進行比較。利用鼠抗X1菌株的多抗血清與四株外膜蛋白進行Western-blot實驗，找出具有免疫特異性的外膜蛋白，旨在發(fā)現(xiàn)菌株X1與其它致病性氣單胞菌共有的具有免疫特異性的外膜蛋白，通