團(tuán)頭魴源嗜水氣單胞菌分離鑒定、檢測(cè)及綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株的構(gòu)建.pdf

1、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)，俗稱武昌魚，是全國推廣的淡水養(yǎng)殖優(yōu)良品種，由于集約化養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在養(yǎng)殖密度越來越高，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，各種病害接踵而至，并呈現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)和流行的趨勢(shì)，給團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 2011年江蘇省常州市武進(jìn)區(qū)養(yǎng)殖的團(tuán)頭魴出現(xiàn)大量死亡，病魚主要表現(xiàn)為行動(dòng)緩慢，攝食量少，浮頭，魚體表出血嚴(yán)重。從患病的團(tuán)頭魴肝臟中分離得1株優(yōu)勢(shì)菌記為W J-8。將菌WJ-

2、8進(jìn)行人工回感試驗(yàn)，其患病癥狀同自然發(fā)病癥狀，證明其對(duì)團(tuán)頭魴有致病性。該菌的形態(tài)特征、主要理化特性、16S rRNA序列測(cè)定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建表明該菌株為嗜水氣單胞菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌對(duì)氟苯尼考、甲哌利福霉素、鏈霉素、卡那霉素等21種藥物敏感，對(duì)青霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、苯唑西林等12種藥物表現(xiàn)出耐藥性。運(yùn)用石蠟包埋及組織切片技術(shù)對(duì)發(fā)病團(tuán)頭魴以及健康團(tuán)頭魴的肝臟、腎臟以及脾臟三種組織進(jìn)行了病理學(xué)研究，病癥主要表現(xiàn)為:三種組

3、織中均有部分細(xì)胞核固縮或腫脹，細(xì)胞破損、壞死，腎臟以及脾臟組織中有鐵血黃素沉著。
　　 根據(jù)GenBank收錄的細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)基因和氣溶素結(jié)構(gòu)基因(aerA)，依據(jù)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)保守序列分別設(shè)計(jì)能檢測(cè)alt和aerA基因的特異性引物，并進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。建立了一種快速檢測(cè)嗜水氣單胞菌雙重PCR方法。結(jié)果顯示，在同一PCR反應(yīng)體系中，供試菌株嗜水氣單胞菌擴(kuò)增2

4、條目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小分別為200 bp和280 bp，而對(duì)照菌株溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae),河流弧菌(Vibrio fluxialis)的PCR擴(kuò)增則沒有條帶檢出。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該雙重PCR最低能檢測(cè)3×104CFU/mL菌體濃度的嗜水氣單胞菌，對(duì)嗜水氣單胞菌模板DNA的檢出極限為49 fg/

5、μL;對(duì)嗜水氣單胞菌的強(qiáng)毒株、弱毒株以及無毒株也進(jìn)行了試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒株以及弱毒株有目的條帶;同時(shí)對(duì)送檢的患病水產(chǎn)品進(jìn)行抽檢，檢測(cè)出陽性結(jié)果的樣品均可分離到優(yōu)勢(shì)生長的嗜水氣單胞菌。結(jié)果證實(shí)，試驗(yàn)所建立的基于2種基因的雙重PCR方法快捷、靈敏，為今后由于該菌所引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病的檢測(cè)提供了參考依據(jù)。
　　 利用生產(chǎn)中常用的10種藥物分別進(jìn)行了其對(duì)分離菌的MIC以及MBC測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸金霉素對(duì)分離菌株的抑菌效果以及殺菌效果最好

6、，分別為2μg/mL、4μg/mL;其次為氟苯尼考、恩諾沙星以及硫酸鏈霉素，這3種抗菌藥物的最小抑菌濃度以及最小殺菌濃度均小于10μg/mL。
　　 實(shí)驗(yàn)以綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFPuv(Clontech)為基礎(chǔ)，通過抗性基因改造構(gòu)建了熒光粒pEGFPuv-Kar。通過電擊轉(zhuǎn)化法成功導(dǎo)入到嗜水氣單胞菌株WJ-8中并且得以表達(dá)。質(zhì)粒在嗜水氣單胞菌WJ-8中的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果顯示直至接種第12次質(zhì)粒穩(wěn)定性為100％，至第21次，質(zhì)粒穩(wěn)